金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的:探讨金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化的影响。方法:将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组、吡非尼酮组(100μg/g)、金匮肾气丸低剂量组(1.0g/kg)、金匮肾气丸高剂量组(2 g/kg),每组6只。建立UUO大鼠肾纤维化模型,造模结束即灌胃给药,各药物组灌胃相应药物,假手术组和模型对照组灌胃质量分数为5 g/L羧甲基纤维素钠,1 d 1次,连续14 d。末次给药后24 h,处死大鼠,取左侧肾组织。固定制片,采用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和马松三色染色法(masson-trichrome staining,Masson)观察肾组织病理学改变,采用免疫组织化学法检测Ⅲ型胶原、肌动蛋白α(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和上皮钙黏素在肾组织的蛋白表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素在肾组织的信使核糖核酸(mRNA)水平。结果:与模型对照组对比,金匮肾气丸组大鼠的肾间质损伤指数降低,间质胶原阳性面积减少,Ⅲ型胶原和α-SMA的蛋白表达减少,上皮钙黏素蛋白表达升高,Ⅲ型胶原和α-SMA蛋白的信使核糖核酸(mRNA)表达减少,上皮钙黏素蛋白mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:金匮肾气丸可以减轻UUO大鼠梗阻肾组织肾间质损伤,减少间质内胶原沉积,减轻肾脏纤维化程度,其作用机制可能与减少Ⅲ型胶原、α-SMA的蛋白和mRNA表达,增加上皮钙黏素的蛋白和mRNA表达有关。     

金匮肾气丸对腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠的影响

目的:研究金匮肾气丸对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的保护作用,并探讨其作用机制。方法:96只SD大鼠随机分成正常组、模型组、氯沙坦组(5 mg·kg-1)和金匮肾气丸高、中、低剂量组(2.4,1.2,0.6 g·kg-1),采用腺嘌呤灌胃(200 mg·kg~(-1)·d~(-1))诱导肾间质纤维化大鼠模型,2 h后灌胃给予相应药物,造模连续9周;给药连续16周。采用生化法测定血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理改变情况;马松(Masson)染色观察大鼠肾脏胶原沉积情况;以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定大鼠肾脏组组转化生长因子-β1(TGF-β1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),钙黏蛋白(E-cadherin),Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ),Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ),Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-2(MMP-2),基质金属蛋白酶-9(MMP-9),基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1),基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)mRNA的表达;以免疫组化法测定大鼠肾脏TGF-β1,α-SMA和E-cadherin的表达。结果:与正常组比较,模型组中SCr和BUN显著升高(P0.01),给予金匮肾气丸干预后SCr和BUN水平降低(P0.05);HE染色和Masson染色结果显示,与正常组比较,模型组肾间质损伤严重且肾间质胶原物质大量沉积,给予金匮肾气丸干预后肾间质小管损伤减轻,肾间质胶原物质沉积减少;Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA表达上调(P0.05),模型组E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA表达下调(P0.05),给予金匮肾气丸干预后E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达上调(P0.05),TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表达明显下调(P0.05);免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组E-cadherin蛋白表达下调(P0.01),TGF-β1和α-SMA蛋白表达上调,金匮肾气丸干预后E-cadherin蛋白表达上调(P0.05),TGF-β1和α-SMA蛋白表达下调(P0.05)。结论:金匮肾气丸可有效改善肾间质纤维化并对肾脏有一定的保护作用,其改善肾间质纤维化的机制可能与降低基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1,TIMP-2)活性,TGF-β1蛋白表达,α-SMA蛋白表达,升高基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-2,MMP-9)活性,E-cadherin蛋白表达,从而减少胶原物质的沉积有关。     

益气养阴活血汤调控SIRT1/AMPK通路改善短暂高糖所致肾损伤作用机制研究

目的:研究益气养阴活血汤通过调控HK-2细胞沉默信息调节因子1(Sirt1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路缓解短暂高糖所致细胞持续性氧化应激损伤的作用机制。方法:对低糖组、高糖组、短暂高糖组、短暂高糖+益气养阴活血汤组的HK-2细胞,蛋白质印迹法(Western blot)测Sirt1、腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶亚基p67~(phox)蛋白表达水平及AMPK活性,DCF法测活性氧(ROS)水平,观察各组上述因子的表达差异。结果:相较低糖组,高糖组、短暂高糖组的Sirt1蛋白表达及p AMPK-α2/AMPK-α2比例均下降,p67~(phox)蛋白表达、ROS水平均上升(P0.05);相较短暂高糖组,短暂高糖+益气养阴活血汤组SIRT1蛋白表达、p AMPK-α2/AMPK-α2比例均上升,p67~(phox)蛋白表达、ROS水平下降(P0.05)。结论:益气养阴活血汤可通过缓解短暂高糖引起HK-2细胞Sirt1表达下降及AMPK活性下降,抑制NADPH氧化酶活性增加、减少短暂高糖所致的持续性氧化应激反应,从而减轻短暂高糖导致的肾损伤。     

皮内针刺激足三里对STZ诱导的2型糖尿病大鼠损伤的影响

目的观察皮内针刺激足三里对STZ诱导的2型糖尿病大鼠损伤的影响。方法雄性Wistar大鼠30只,分为A组(正常组)、B组(模型组)、C组(皮内针组),采用尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)结合高脂饲料建立2型糖尿病大鼠模型,检测大鼠空腹血糖、血清中活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及胰岛素(Insulin)水平。采用HE染色法观察各组大鼠胰岛组织的变化情况,采用PCR法检测p22phox、NOX4的m RNA水平。采用Western blot法检测各组大鼠氧化应激相关蛋白p22phox、NOX4的表达情况。结果结果显示,B组、C组与A组比较,ROS、MDA水平明显升高,而SOD及胰岛素水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。C组与B组比较,ROS、MDA水平降低(P0.05),SOD及胰岛素水平明显升高(P0.05)。HE染色结果显示,A组胰腺胰岛内细胞排列整齐,大小一致,分布均匀;B组胰岛内细胞分布稀疏,形状不规则,排列紊乱,可见空泡样变;C组胰岛内细胞结构明显改善。PCR结果显示,B组、C组p22phox、NOX2 mRNA含量与A组比较差异有统计学意义(P0.05)。C组p22phox、NOX2m RNA水平明显低于B组(P0.05)。Western blot结果显示,B组、C组p22phox和NOX2蛋白含量与A组比较差异有统计学意义(P0.05)。C组p22phox、NOX2蛋白含量比B组明显减少(P0.05)。结论皮内针刺激足三里对STZ诱导的T2MD大鼠的损伤有改善作用,其作用机制是通过缓解机体的氧化应激起作用。     

山萘酚和芒柄花黄素对缺氧心肌细胞内NADPH氧化酶相关亚基的调控作用

目的:分析中药单体山萘酚和芒柄花黄素对缺氧条件下H9c2心肌细胞内活性氧水平及NADPH氧化酶亚基NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)表达量的影响。方法:采用缺氧造模的方法对H9c2心肌细胞进行造模,通过倒置荧光显微镜观察DCFH-DA染色的H9c2心肌细胞的荧光强弱;Real time PCR和Western blot检测NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)表达量变化。结果:各组细胞内绿色荧光有显著变化,即对照组的细胞内荧光微弱,模型组荧光强度显著增强,各给药组荧光强度有所减弱,作用与阳性药组相似;山萘酚能够有效降低NOX4、p67~(phox)、p47~(phox) mRNA的表达量,芒柄花黄素能够有效降低NOX4、p47~(phox) mRNA的表达量;山萘酚能够有效降低NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)蛋白的表达量,芒柄花黄素能够有效降低NOX4、p67~(phox)蛋白的表达量。结论:抑制NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)的表达量可能是山萘酚和芒柄花黄素发挥抗氧化作用的重要环节,而对于NADPH氧化酶的影响反映了H9c2心肌细胞内活性氧的水平。     

金匮肾气丸通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用

[目的] 探究金匮肾气丸对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的作用及其可能的作用机制。[方法] 40只SD大鼠随机分为空白对照组、COPD组、金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组,每组各8只。除空白对照组外,其余组大鼠采用烟熏联合气管内滴注脂多糖（LPS）法建立COPD大鼠模型。各组给予相应药处理AniRes2005动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能;酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17（IL-17）水平;苏木精-伊红（HE）染色检测肺组织病理学变化;TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;蛋白质免疫印迹（Western blot）检测自噬及磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径相关蛋白的表达。[结果] 与空白对照组相比,COPD组大鼠肺功能降低,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显升高（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;与COPD组相比,金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组大鼠肺功能升高,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显降低（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。[结论] 金匮肾气丸可能通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬,延缓大鼠慢性阻塞性肺疾病进展。     

肝豆汤对Wilson病模型高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应的影响及其作用机制

目的:研究肝豆汤对高铜诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞自噬效应的影响及其作用机制,为中医药防治脑型Wilson病(Wilson disease,WD)提供新的治疗靶点和研究思路。方法:噻唑蓝(MTT)比色法筛选硫酸铜(CuSO_4)造模浓度(0,100,200,400,800,1 600μmol·L-1)及时间; MTT比色法筛选含药血清浓度(5%,10%,15%,20%)及时间;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞LDH漏出率;流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS)的含量;荧光染料JC-1检测细胞线粒体膜电位;流式细胞仪对自噬进行定量分析。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝激酶B1(LKB1),腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),自噬微管相关蛋白轻链3A/B(LC3A/B),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),unc-51样激酶1(ULK1),磷酸化ULK(p-ULK),磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白的表达。结果:MTT结果显示,CuSO_4对细胞的损伤呈现一定的量效和时效关系(P 0. 01),随着CuSO_4作用浓度及时间的增加,细胞存活率呈现下降趋势; 10%含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞死亡(P 0. 01)。LDH释放实验显示,与正常组比较,CuSO_4作用细胞后LDH漏出率显著增加(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显降低CuSO_4损伤细胞的LDH漏出率(P 0. 05)。DCFH-DA荧光染色显示,与正常组比较,CuSO_4可显著增加细胞内ROS生成(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞内ROS产生(P 0. 01)。JC-1染色结果显示,与正常组比较,CuSO_4诱导细胞线粒体膜电位Δψm显著降低(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显抑制CuSO_4诱导的线粒体膜电位降低Δψm(P 0. 05)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组细胞内LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白的表达显著增加,mTOR及p-ULK蛋白的表达显著降低(P 0. 01)。与模型组比较,含肝豆汤兔血清组LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白表达显著降低,mTOR及p-ULK蛋白表达显著增加(P 0. 01)。结论:高铜可通过诱导细胞内线粒体氧化应激,上调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,AMPK,LC3A/B及ULK1的表达,下调自噬相关蛋白mTOR及p-ULK的表达,导致细胞发生自噬性死亡,而肝豆汤可通过调控LKB1/AMPK信号通路,下调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,LC3A/B,ULK及AMPK的表达,上调自噬相关蛋白及基因mTOR及p-ULK的表达,抑制自噬的发生,阻断高铜诱导的神经元损伤,从而发挥神经保护作用。     

参苓白术散抗炎症性肠病作用与调节肠上皮细胞自噬的关系探讨

目的:探讨参苓白术散通过调节肠上皮细胞自噬对5%葡聚糖硫酸钠(DSS)所致小鼠炎症性肠病(IBD)的改善作用。方法:84只BALB/c小鼠随机分为7组,每组12只。除正常组之外,5%DSS自由饮用7 d诱导急性炎症性肠病,治疗组分别给予参苓白术散高、中、低剂量(12,6,3 g·kg~(-1)·d~(-1)),美沙拉嗪(2 g·kg~(-1)·d~(-1)),自噬诱导剂雷帕霉素(4 mg·kg~(-1)·d~(-1))灌胃。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠结肠组织的病理形态学变化;透射电镜检测肠上皮细胞自噬体形成情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR),泛素结合蛋白~(-1)(p62),Beclin1磷酸化,ULK1,4EBP蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠结肠黏膜上皮细胞广泛缺失,腺体大多数不完整,呈结肠炎改变,LC3-Ⅱ含量明显降低(P 0. 05),自噬不明显,而自噬水平增加,结肠组织中自噬通路蛋白PI3K,mTOR,p-p62磷酸化程度及ULK1蛋白表达明显升高(P 0. 05),Beclin1磷酸化程度及4EBP蛋白表达明显降低(P 0. 05);与模型组比较,参苓白术散中、高剂量组,美沙拉嗪组及雷帕霉素组结肠组织明显改善,LC3-Ⅱ含量均明显升高(P 0. 05),参苓白术散高、中、低剂量组,美沙拉嗪组及其对应的抑制剂组可明显抑制PI3K,mTOR,p-p62磷酸化,降低ULK1蛋白表达,促进Beclin1磷酸化及升高4EBP蛋白表达(P 0. 05)。结论:参苓白术散抗DSS诱导的IBD的作用与调节肠上皮细胞自噬通路蛋白PI3K,mTOR,p62的磷酸化有关。     

电针对功能性消化不良大鼠胃窦AMPKα及mTOR的影响

目的观察电针足三里对功能性消化不良(FD)大鼠腺苷酸激活蛋白激酶(AMPKα)、雷帕霉素靶蛋白(m TOR)表达的影响。方法将50只大鼠按随机数字表法分为正常组及造模组,其中正常组10只。将除正常组外的大鼠采用夹尾刺激法配合不规则饮食构建FD大鼠模型,将造模成功的大鼠再随机分为模型组和电针组,各10只。正常组、模型组大鼠与电针组一样束缚固定,但不进行电针干预。电针组给予电针足三里进行干预,每日1次,共10 d。观察各组大鼠日常表现,采用q RT-PCR检测各组大鼠胃窦组织中AMPKα和m TOR mRNA的表达;用Western blotting检测各组大鼠胃窦AMPKα、m TOR蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠胃窦AMPKαmRNA以及蛋白的表达显著降低(P 0.05),mTOR m RNA以及蛋白的表达显著升高(P 0.05)。与模型组比较,电针组胃窦中AMPKαm RNA以及蛋白的表达明显升高(P 0.05),mTOR mRNA以及蛋白的表达明显降低(P 0.05)。结论电针足三里可改善FD大鼠的胃肠消化,增加FD大鼠胃窦AMPKαmRNA以及蛋白的表达水平,降低FD大鼠胃窦mTOR m RNA以及蛋白的表达水平。     

人参-三七-川芎提取物延缓高糖诱导的小鼠血管衰老的机制探讨

目的:从单磷酸腺苷活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)通路探讨人参-三七-川芎提取物对高糖诱导的小鼠血管衰老的保护作用。方法:130只雄性C57BL/6小鼠先随机分为空白组和高糖组,高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ),并用高脂饮食连续性喂养7个月后再次随机分组,分为模型组、人参-三七-川芎提取物低剂量组(0.819 g·kg~(-1))、人参-三七-川芎提取物高剂量组(1.638 g·kg~(-1))及二甲双胍组(150 mg·kg~(-1)),灌胃给药,每天1次,连续9周,期间检测小鼠体质量和血糖变化。给药结束后,苏木素-伊红(HE)染色检测小鼠胸主动脉形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠胸主动脉周期蛋白依赖激酶抑制因子2A(p16),周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21),AMPK,p-AMPK,mTOR,pmTOR,肝激酶B1(LKB1),p-LKB1,核糖体蛋白s6激酶(p70s6k),p-p70s6k蛋白表达情况。结果:与空白组相比,模型组小鼠体质量显著降低、血糖显著升高(P0.01),在药物干预9周后,各给药组小鼠体质量无明显差异,血糖值较模型组明显下降(P0.05,P0.01)。与空白组相比,模型组内膜损伤严重且有增生,中膜明显增生且排列不整齐,给药各组内膜损伤不明显,中膜少量增生,p16,p21,mTOR,p-mTOR,p70s6k,p-p70s6k蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01),AMPK,p-AMPK,LKB1,p-LKB1蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01)。药物干预后,各给药组p16,p21,mTOR,p-mTOR,p70s6k,p-p70s6k蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01),AMPK,p-AMPK,LKB1,p-LKB1蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01)。结论:高糖能够诱导小鼠主动脉衰老,人参-三七-川芎提取物可能通过AMPK/mTOR通路改善由高糖诱导的小鼠主动脉衰老。     

基于AMPK/mTOR通路介导的自噬探讨温补固肾方 对糖尿病肾纤维化的影响

目的：探究温补固肾方调控AMPK/mTOR通路介导的自噬途径对糖尿病肾纤维化的保护机制。方法：雄性SPF级SD大鼠100只，除对照组20只外，均采用腹腔注射链脲佐菌素（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。其中60只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、达格列净组（1.0 mg/kg）、温补固肾方低、中、高剂量组（0.92、1.84、3.68 g/kg），每组各10只。给予相应药物灌胃12周后，检测各组大鼠肾功能生化指标；HE和PAS染色观察肾组织病理形态变化；免疫组化法检测肾组织α-SMA,E-Cadherin表达；电镜观察自噬小体形成；Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR表达。剩余40只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、温补固肾方高剂量组（3.68 g/kg）、温补固肾方高剂量组+AMPK抑制剂组（20 mg/kg），每组各10只。给予相应药物12周后，检测大鼠肾功能生化指标，电镜观察肾组织病理形态，Masson染色观察肾纤维化程度，Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及AMPK/mTOR通路蛋白表达。结果：与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾功能损伤严重，并伴有明显的病理损伤，肾组织α-SMA表达增加，E-Cadherin表达降低（P <0.01），自噬小体数量减少（P <0.01）,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK/AMPK比值降低，p-mTOR/mTOR比值增加（P <0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠肾功能及组织病理性损伤均有不同程度改善，α-SMA表达降低，E-Cadherin表达增加（P <0.05,P <0.01），自噬小体数量增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK/AMPK比值增加，p-mTOR/mTOR比值降低（P <0.05,P <0.01）。与温补固肾方高剂量组比较，AMPK抑制剂能够逆转温补固肾方糖尿病肾病大鼠的治疗作用，抑制上述相关指标变化。结论：温补固肾方能够激活AMPK/mTOR通路介导的自噬改善糖尿病大鼠肾纤维化。     

大黄虫丸对H2O2诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

目的研究大黄■虫丸对H_2O_2诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响,并探讨其分子机制。方法制备大鼠大黄■虫丸血清和正常血清;将肝星状细胞(HSCs)分为正常血清低浓度H_2O_2(50 nmol/L)组、大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组、正常血清高浓度H_2O_2(100μmol/L)组和大黄■虫丸血清高浓度H_2O_2组,应用化学荧光和流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平。蛋白质免疫印迹实验中,将HSCs分为正常血清组、大黄■虫丸血清组、正常血清低浓度H_2O_2(50 nmol/L)组和大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组,以检测ROS生成相关分子RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK的表达。结果正常血清高浓度H_2O_2组和大黄■虫丸血清高浓度H_2O_2组细胞内均有较强ROS荧光,但两组之间差异无统计学意义(P0.05);大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组细胞的ROS荧光强度明显弱于正常血清低浓度H_2O_2组(P0.01);与正常血清组比较,正常血清低浓度H_2O_2组RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与正常血清低浓度H_2O_2组比较,大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK蛋白表达下调(P0.01)。结论大黄■虫丸可能通过调控RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK等分子,参与拮抗H_2O_2诱导的氧化应激,阻止ROS的生成,并最终抑制HSCs活化、增殖,防治肝纤维化。     

复方七芍降压片对SHR氧化应激及p22phox蛋白表达的影响

目的:观察复方七芍降压片对SHR氧化应激的减弱作用。方法:48只SHR按血压分层随机分为4组,即模型组(SHR-M)、厄贝沙坦组(SHR-E)、低剂量治疗组(SHR-D)、高剂量治疗组(SHR-G),每组12只,12只WKY大鼠为空白对照组。连续灌胃12周,观察SHR胸主动脉血浆SOD、血清MDA和ROS以及胸主动脉p22phox蛋白的表达的变化。结果:与空白对照组比较,SHR各组血浆SOD明显降低,血清MDA、ROS水平明显升高,胸主动脉p22phox蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义((P0.05,P0.01)。复方七芍降压片治疗后,高剂量组SHR血浆SOD显著升高(P0.05),血清MDA、ROS水平显著降低(P0.05),胸主动脉p22phox蛋白表达量明显降低(P0.01),低剂量组各项指标与模型组比较无统计学意义(P0.05)。结论:复方七芍降压片通过上调血浆SOD水平,降低血清MDA、ROS浓度,改善SHR氧化应激状态,从而达到降低血压的作用。     

金匮肾气汤对糖尿病肾病大鼠HMGB1和自噬信号Beclin1表达的影响

目的:探讨金匮肾气汤(JKSQ)对糖尿病肾病(DN)大鼠高迁移率族蛋白B(HMGB1)和自噬信号Beclin1表达的影响。方法:60只大鼠随机分为对照组、模型组和JKSQ高、中、低剂量组(3.6g/kg/d、1.8g/kg/d、0.9g/kg/d),各12只,均采用高脂饲料联合腹腔注射40mg/kg链脲佐菌素复制DN模型。药物干预3周后,测定空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24h尿蛋白、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-1β水平;Western Blot测定HMGB1、Toll样受体4(TLR4)、微管相关蛋白I轻链3-I(LC3-I)、LC3-Ⅱ、Beclin 1和p62蛋白表达。结果:与对照组比,模型组大鼠FBG、24h尿蛋白、BUN、Scr、TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高(P0.05),HMGB1、TLR4和p62蛋白表达升高(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1蛋白表达下降(P0.05);与模型组比,JKSQ高剂量组大鼠FBG、24h尿蛋白、BUN、Scr、TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低(P0.05),HMGB1、TLR4和p62蛋白表达下降(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1蛋白表达升高(P0.05)。结论:JKSQ可以抑制HMGB1蛋白表达,促进Beclin 1介导的自噬,减轻DN大鼠肾组织损伤。     

右归丸对D-半乳糖致亚急性衰老大鼠抗氧化能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察补肾经典方右归丸抗衰老作用机制。方法以金匮肾气丸作对比观察了右归丸对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老大鼠血清和肾组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含有量及对肾组织凋亡相关基因Bax及Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)蛋白表达的影响。结果亚急性衰老大鼠血清和肾组织中的SOD含有量明显下降、MDA含有量明显升高,对于血清中的SOD和MDA的含有量,右归丸和金匮肾气丸均有显著的逆转作用;对肾组织中的SOD的提高,两方均无明显的效果;对肾组织中的MDA影响,右归丸的作用不明显,金匮肾气丸可显著降低MDA的含有量;对于Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达,两方可显著下调促凋亡因子Bax、Caspase-3的蛋白表达,上调抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达。结论右归丸和金匮肾气丸可能都是通过改善抗氧化能力、下调促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达和上调抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达的作用发挥延缓衰老的效果。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨炙甘草汤抗大鼠MIRI致室速和室颤的作用机制

目的:通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,探讨炙甘草汤干预心肌缺血再灌注损伤(MIRI)致心律失常(室速和室颤)的作用及其机制。方法:将72只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,炙甘草汤低、中、高剂量组(11.43,22.86,45.72 g·kg~(-1)),稳心颗粒组(2.43 g·kg~(-1)),连续给药干预10 d。末次给药2 h,采用结扎冠状动脉左前降支法制备大鼠MIRI模型,记录心电图的变化。造模成功后采集血液及心脏组织,检测血清中肌酸肌酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)及丙氨酸氨基转移酶(AST)的含量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测心肌肌钙蛋白(CtnI)的含量;免疫组化法检测心肌PI3K,Akt,mTOR的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC-3),自噬标志物Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达及磷酸化p-PI3K,p-Akt,p-mTOR的水平。结果:模型组大鼠100%发生室速,91.67%发生室颤;与假手术组比较,模型组大鼠血清CK,LDH,AST以及CtnI的含量显著升高(P0.01),心肌组织中PI3K,Akt,mTOR表达显著升高(P0.01),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1的相对表达量显著升高(P0.01),p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR显著降低(P0.01);与模型组比较,炙甘草汤高剂量组室速、室颤发生率显著降低(P0.01),较其他给药组持续时间短(P0.01);炙甘草汤高剂量组CK,LDH,AST水平及CtnI含量显著降低(P0.01);炙甘草汤给药组的PI3K,Akt,mTOR的表达随剂量的增加而显著降低(P0.01);LC-3,Beclin1的表达随炙甘草汤各剂量组的增加有不同程度地下降(P0.01),而PI3K/Akt/mTOR相关蛋白表达比值明显升高(P0.05,P0.01)。结论:炙甘草汤预处理能使异常升高的心肌酶CK,LDH,AST,CtnI降低,抑制细胞的过度自噬,上调PI3K,Akt和mTOR的表达,说明炙甘草汤抗MIRI致心律失常的作用可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

梓醇对TNF-α诱导的HAECs细胞损伤抑制作用的机制研究

梓醇是从中药地黄的根中提取出的一种环烯醚萜葡萄糖苷类化合物,据报道有抗氧化应激作用。腺苷5'磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)在抑制氧化应激方面起到重要作用。该研究通过对氧化应激相关指标的检测探讨梓醇对TNF-α诱导的人主动脉内皮细胞(human aorta epithelial cells,HAECs)细胞损伤的抑制作用,通过siRNA技术检测其调控氧化应激与AMPK的关系。采用比色法测定细胞中SOD,MDA,GSH和LDH水平,流式细胞仪测定ROS生成水平。免疫印迹(Westernblot)法检测细胞中AMPK,磷酸化AMPK和NOX4的表达。RNA干扰技术敲低AMPK水平,通过再次检测各项指标探讨梓醇抑制氧化应激与其激活AMPK的相关性。结果表明,TNF-α诱导损伤的HAECs磷酸化AMPK表达下降,而梓醇上调AMPK的磷酸化水平。未转染AMPK siRNA前,梓醇能够抑制TNF-α诱导的NOX4蛋白表达上调,并减少ROS生成,AMPK siRNA作用后,梓醇对ROS过度生成、NOX4蛋白表达上调的抑制作用均减弱。以上结果提示,梓醇通过激活AMPK抑制细胞中氧化应激,进而抑制TNF-α诱导的HAECs细胞损伤。     

化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏和AMPK/Nox4信号通路的作用研究

目的探讨化瘀通络中药对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾脏的保护作用以及对腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,Nox4)信号通路的干预作用。方法随机选取7只SD大鼠作为对照组,其余大鼠采用高糖高脂饲料喂养联合ip链脲佐菌素(35 mg/kg)建立DN模型,DN大鼠随机分为模型组、化瘀通络中药(4.41 g/kg)组和厄贝沙坦(13.5 mg/kg)组。给予化瘀通络中药16周后,取尿液检测大鼠24h尿蛋白(urinetotalprotein,UTP)和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)水平;考察各组大鼠肾组织病理变化;考察各组大鼠肾组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛水平;采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织8-OHdG和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白表达;采用qRT-PCR法检测肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)m RNA表达;采用Western blotting法检测各组大鼠肾组织TGF-β1、AMPKα、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)、Nox4蛋白表达。结果与模型组比较,化瘀通络中药组大鼠尿液24 h UTP和8-OHdG水平明显降低(P0.01);肾脏病理损伤缓解,肾组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)堆积减少,肾组织胶原面积明显降低(P0.01);肾组织SOD活性明显升高(P0.05),肾组织丙二醛水平显著下降(P0.01);肾组织8-OHd G和FN表达减少;肾组织TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05、0.01);肾组织p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高(P0.05),Nox4蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论化瘀通络中药能够通过作用于AMPK/Nox4信号通路,从而抑制DN大鼠氧化应激、减少ECM大量堆积、降低UTP排泄、保护肾脏。     

从AMPK/mTOR通路探讨人参-三七-川芎提取物对糖尿病小鼠心脏老化的保护作用机制

目的:从AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的活化及心脏病理形态学变化、相关衰老蛋白的改变,探讨人参-三七-川芎提取物(GNC)对糖尿病小鼠心脏老化的保护作用机制。方法:C57BL/6雄性小鼠,SPF级,随机分为正常组和高糖组。高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)联合喂食高脂饲料,造模成功后再次随机分为模型组,GNC低剂量组(0. 819 g·kg~(-1)),GNC高剂量组(1. 638 g·kg~(-1))及二甲双胍组(150 mg·kg~(-1))。每天1次,灌胃给药,连续9周,监测血糖变化。4周龄雄性C57BL/6小鼠正常喂养1周,为青年组。观察小鼠一般情况,苏木素-伊红(HE)染色结合透射电镜(TEM)观察小鼠心脏病理形态学变化,冯库萨(Von Kossa)染色判断小鼠心脏微血管钙盐沉积程度,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠心脏组织中AMPK/mTOR信号通路活化状态,以及衰老相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2),抑癌基因p53(p53),磷酸化抑癌基因p53(p-p53)表达。结果:与正常组比较,模型组血糖显著升高(P 0. 01);与模型组比较,各给药组血糖明显下降(P 0. 05,P 0. 01)。HE,TEM,Von Kossa 3个病理形态学实验结果显示:与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞肥大,心肌纤维排列紊乱、灶性溶解坏死,线粒体肿胀、变性、嵴断裂、空泡变,心脏微血管结构紊乱、染色不均匀、中内膜有大量钙盐沉积;与模型组比较,各给药组小鼠病理形态学变化均有不同程度的改善。与正常组比较,模型组MMP-2,p53和p-p53蛋白表达明显升高(P 0. 05,P 0. 01),p-肝激酶B1 (LKB1)/LKB1,p-AMPK/AMPK蛋白明显降低(P 0. 05,P 0. 01),p-mTOR/mTOR,p-核糖体蛋白S6激酶p70S6K/p70S6k蛋白显著升高(P 0. 01);与模型组比较,各给药组MMP-2,p53和p-p53蛋白表达明显降低(P 0. 05,P 0. 01),p-LKB1/LKB1,p-AMPK/AMPK蛋白明显升高(P 0. 05,P 0. 01),p-mTOR/mTOR,p-p70S6k/p70S6k蛋白明显降低(P 0. 05,P 0. 01)。结论:STZ联合高脂饲料能够诱导小鼠心脏老化,GNC能够改善糖尿病小鼠心脏老化,其作用机制可能与调控AMPK/mTOR通路相关蛋白表达有关。     

基于p38MAPK通路初探大黄黄芩配伍对内毒素血证模型大鼠肝脏炎症的调节机制

为了探究大黄黄芩药对对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的内毒素血证模型大鼠肝脏炎症的调节机制,选取取雄性SD大鼠50只,随机分为空白组、模型组、地塞米松组、药对高剂量组、药对低剂量组,每组10只。各组大鼠给予相应药物进行预防性给药,连续给药7 d。末次给药结束0.5 h后尾静脉注射LPS(5 mg·kg~(-1))造模,后每0.5 h测定一次动物肛温并记录,于造模后4 h处死动物,测定脾脏胸腺系数;采用ELISA法检测肝组织中细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;采用比色法测定肝组织中一氧化氮(NO)含量;采用Western blot法检测肝组织中Toll样受体蛋白4(Toll样受体-4),p38MAPK,磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)及一氧化氮合成酶(i NOS)蛋白相对表达量。结果显示,与空白组大鼠相比,模型组大鼠肝组织中TLR4蛋白表达、iNOS蛋白表达、p38磷酸化表达升高,IL-1β,NO,TNF-α含量显著升高(P0.05或P0.01)。与模型组比较,药对高剂量能显著降低大鼠肝组织中IL-1β,NO,TNF-α的表达(P0.05或P0.01),下调i NOS蛋白表达与p38磷酸化表达(P0.05),但对TLR4蛋白并未出现显著的回调作用;药对低剂量能显著降低模型大鼠肝组织中IL-1β,NO的表达(P0.01),显著下调i NOS蛋白表达(P0.01),对p38磷酸化表达具有一定的下调趋势但不具有统计学意义,而对TLR4蛋白表达并没有表现出一定降低作用。大黄黄芩配伍使用可能是通过减少p38蛋白的磷酸化表达从而阻断p38 MAPK信号通路,来减少i NOS蛋白表达和炎性因子IL-1β,NO,TNF-α的释放,从而达到减缓炎症反应保护机体组织的作用。