6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间的黏附性增强

目的　探讨 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制对人T淋巴母细胞Jurkat生物学行为的影响。方法　采用反义核酸技术抑制细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达。用PCR检测转导基因在基因组中的整合。用单抗 6A8作探针 ,Western印迹和免疫荧光染色流式细胞术检测细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达状况。用ConA结合试验检测细胞蛋白质的糖基化改变。普通光学显微镜观察细胞的形态。用DNA芯片技术分析AS细胞和M细胞mRNA表达的差异。用RT PCR和免疫荧光染色流式细胞术验证基因芯片结果的可靠性。结果　制备了 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞 (AS)。与对照细胞 (野生型细胞W和转导空载体的细胞M)相比 ,AS细胞在培养中黏附成大团块。DNA芯片分析见与M细胞相比 ,AS细胞中有 19个基因的表达上调 ,2 0个基因的表达下调。上调的基因中有一些与细胞间黏附相关 ,如CD5 4、CD11a、CD2 4、CD82、整合素αX、整合素α7、整合素αE、IL 1R、IL 2Rγ和TNFSF9。RT PCR肯定了DNA芯片分析的可靠性。免疫荧光染色流式细胞术进一步肯定了CD5 4和CD11a在AS细胞表达的上调。结论　 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间黏附增强 ,CD5 4和CD11a等黏附分子表达的增高可能与此相关。     

6A8α-甘露糖甘酶表达抑制使Jurkat细胞间的黏附性增强

目的 探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对人T淋巴母细胞Judua生物学行为的影响。方法 采用反义核酸技术抑制细胞中6A8α-甘露糖苷酶的表达。用PCR检测转导基因在基因组中的整合。用单抗6A8作探针，Westem印迹和免疫荧光染色流式细胞术检测细胞中6A8α-甘露糖苷酶的表达状况。用Con A结合试验检测细胞蛋白质的糖基化改变。普通光学显微镜观察细胞的形态。用DNA芯片技术分析AS细胞和M细胞mRNA表达的差异。用RT-PCR和免疫荧光染色流式细胞术验证基因芯片结果的可靠性。结果 制备了6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞(AS)。与对照细胞(野生型细胞W和转导空载体的细胞M)相比，AS细胞在培养中黏附成大团块。DNA芯片分析见与M细胞相比，AS细胞中有19个基因的表达上调，加个基因的表达下调。上调的基因中有一些与细胞间黏附相关，如CD54、CD11a、CD24、CD82、整合紊αX、整合紊α7、整合素αE、IL-1R、IL-2Rγ和TNFSF9。RT-PCR肯定了DNA芯片分析的可靠性。免疫荧光染色流式细胞术进一步肯定了CD54和CD11a在AS细胞表达的上调。结论 6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使Judua细胞间黏附增强，CD54和CD11a等黏附分子表达的增高可能与此相关。     

CD59锚定蛋白对CD55介导的T细胞信号转导的增强效应

目的:研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59对CD55介导T细胞信号转导的增强效应。方法:实验分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)及转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)。用RT-PCR检测3组细胞中的CD59基因表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法、免疫印迹技术和激光共聚焦扫描显微镜分别检测CD55与CD59联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应,Src家族酪氨酸激酶(SrcPTK)磷酸化的水平及细胞内钙离子的变化。结果:稳定转染后,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被成功抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD55与CD59联合作用后增殖能力,SrcPTK磷酸化水平及钙离子浓度均明显高于Ⅲ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组之间无差异。结论:CD59可增强CD55对T细胞信号转导的效应。     

CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。     

CD59锚定蛋白对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导中的增强效应

目的用前期构建好的CD59pSUPER-RNAi质粒转染Jurkat细胞,探讨CD59特异性沉默前后CD59对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导的相关作用。方法采用Lipofectamine2000转染Jurkat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系,利用RT-PCR检测转染后CD59在基因水平的表达抑制效果。实验分为未转染的Jurkat细胞组(A组),转染空质粒pSUPER组(B组)和转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组(C组),用噻唑蓝(MTT)比色法,Western blot技术和激光共聚焦扫描显微镜分别检测交联CD59单抗与固相化CD3单抗联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应,ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平及细胞浆内钙离子的变化。结果重组载体转染后,经G418筛选得到稳定转染细胞系,RT-PCR结果表明转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组CD59分子的表达受到抑制。转染干扰质粒Jurkat细胞组CD59与CD3联合作用后细胞增殖能力,ZAP-70酪氨酸磷酸化水平及钙离子浓度均明显低于未转染组和转染空质粒组(P<0.05);但未转染组和转染空质粒组之间无差异。结论 CD59对CD3介导T细胞活化信号转导有增强效应。     

流体剪应力作用下趋化因子CXCL12诱导的白细胞整合素LFA-1的激活

目的探究剪应力下趋化因子诱导的白细胞上整合素LFA-1激活过程。方法采用平行平板流动腔系统在10~30 mPa剪应力下,观察分析可溶性及固定趋化因子CXCL12对Jurkat细胞在ICAM-1上瞬时黏附行为的影响,提取特征参数。结果 CXCL12仅能介导Jurkat细胞的短暂栓缚(0.13~0.20 s)。只有固定的CXCL12才能有效激活Jurkat细胞上LFA-1与ICAM-1键合,从而提高栓缚事件的发生率,并大大延长细胞的栓缚时间(0.8~1.2 s)。激活的LFA-1/ICAM-1解离速率呈现明显双态性:k_1(1.09~1.24 s~(-1)),k_2(0.28~0.7 s~(-1)),剪应力主要通过调节k_2及k_2对整个黏附时间的贡献率β来控制细胞的瞬时黏附行为。结论剪应力通过G蛋白偶联受体与CXCL12的作用可在0.2 s内快速激活整合素LFA-1,进而调控白细胞的黏附过程。研究结果有助于深化趋化因子-力偶联调控整合素激活机制的认识。     

3-MA对三氧化二砷诱导Jurkat细胞凋亡作用的影响

目的:探讨自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对三氧化二砷(As2O3)诱导急性T细胞白血病系Jurkat细胞系Jurkat细胞凋亡的影响及机制。方法:XTT法检测三氧化二砷(As2O3)对急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖抑制作用。电镜下观察不同浓度As2O3作用Jurkat细胞24 h后细胞形态。免疫印迹和流式细胞术检测微管相关蛋白1轻链3B(LC-3B)蛋白的表达变化。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测3-MA对AS2O3诱导急性T细胞白血病系Jurkat细胞凋亡的影响。结果:As2O3可以抑制急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞的生长,这种作用呈剂量和时间依赖性。2.5、5、10μmol/L AS2O3作用Jurkat细胞24 h后在电镜下可观察到自噬、凋亡、坏死的不同形态,并且自噬体数目不断增多。5μmol/L As2O3处理Jurkat细胞0、24、48 h后,LC-3B的平均荧光强度相对倍数分别(3.1±0.2)倍、(4.6±0.31)倍、(34.2±4.5)倍,组间相比,差异有统计学意义(P<0.05),与生长抑制率一样呈现时间依赖性增强;免疫印迹也显示As2O3处理24 h和48 h后,LC-3B的蛋白表达逐渐增强;相对于As2O3组(33.4±9.1)%的生长抑制率,3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合As2O3处理细胞后,48 h的生长抑制率为(60.6±8.3)%,差异明显,而LC-3B的表达明显降低。联合应用自噬抑制剂3-MA后Jurkat细胞的凋亡率(44.96±3.60)%,与单用As2O3组(2.94±0.26)%相比明显增加,差异有统计学意义。结论:自噬抑制剂3-MA可以增加As2O3引起的急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞的凋亡细胞百分数,其作用机制与诱导凋亡及抑制自噬密切相关。     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的　研究双特异单链抗体 (scBsAb)介导的Jurkat细胞 (CD3+ )及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性 ,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性。方法以抗人卵巢癌×抗人CD3scBsAb激活效应细胞 ,以SKOV3为靶细胞 ,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性。结果　 (1)以重组白细胞介素 2 (rIL 2 )、抗CD3单克隆抗体、抗CD2 8重链单域抗体 (VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高 ;(2 )以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性 ,最高杀伤率均在 75 %左右 ;(3)杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关。对于Jurkat细胞 ,在抗体终浓度为 2 1μg ml,反应时间为 4 8h ,效靶比为 10∶1时达到最大杀伤率 74 .8% ;对于PBMC细胞 ,在抗体浓度为 2 0 μg ml,反应时间为 72h ,效靶比为 1∶1时达到最大杀伤率73.1%。 (4 )多因子联合应用能有效提高杀伤活性。结论　scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞 ,有明显的抗癌作用 ,具有潜在的应用前景。     

抗人CD28激发性单抗对T细胞淋巴瘤的抑制作用研究

目的:研究鼠抗人CD28单克隆抗体(克隆号:2F5)对T淋巴细胞瘤的抗肿瘤效应,为抗体介导肿瘤靶向治疗提供新的方法和思路。方法:流式细胞术检测鼠抗人CD28单克隆抗体2F5对人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞表面膜型CD28分子的识别;MTT法检测2F5对Jurkat细胞体外增殖的影响;将Jurkat细胞株接种于裸鼠腋下,建立Jurkat细胞荷瘤裸鼠模型;经瘤内多点注射2F5(注射剂量1μg/mm3),逐日观察肿瘤的大小和裸鼠的生存状态。结果:2F5能够识别Jurkat细胞表面CD28分子,阳性结合率可达93.37%;2F5与Jurkat细胞共培养后,显微镜下观察可见胞质中出现黑色颗粒,胞膜破裂,细胞的折光性和立体感减弱;MTT法分析结果显示,抗CD28单抗对Jurkat细胞的体外增殖具有明显的抑制作用;将Jurkat细胞接种35只裸鼠(成瘤率达70%);经瘤内多点注射2F5,35天后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速率明显降低;而生理盐水对照组肿瘤生长无明显改变。结论:鼠抗人CD28单克隆抗体2F5通过与Jurkat细胞表面膜型CD28分子结合对其增殖具有明显的抑制作用,提示CD28分子可作为治疗T淋巴瘤的一个潜在靶点,抗体对治疗CD28分子阳性的肿瘤具有潜在临床应用价值。     

肺炎链球菌在体外触发人肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排

目的　通过体外实验研究肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae ,S .pn)侵袭A54 9细胞和微丝肌动蛋白细胞骨架重排之间的关系。方法　采用F actin特异性FITC phalloidin荧光染料 ,观察S .pn作用于A54 9细胞前后的F actin细胞骨架重排情况 ;用F actin细胞骨架重排抑制剂———细胞松弛素D预处理A54 9细胞 ,观察S .pn对A54 9细胞的侵袭率 ;分别使用PLC、TPK信号转导抑制剂U7312 2、Genistein处理因素预处理A54 9细胞 ,观察其与F actin细胞骨架重排的关系。结果　S .pn作用A54 9细胞后 ,F actin细胞骨架呈块状、丝状聚集 ;F actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低S .pn对A54 9细胞的侵袭率 ,在其浓度为 0 .2 5 μg ml时 ,未得到可测的细菌数 ;PLC(磷脂酶C)、TPK(酪氨酸蛋白激酶 )信号转导途径抑制剂可部分抑制A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,其相关系数分别为 :rPLC =- 0 .88(P <0 .0 5 ) ;rTPK =- 0 .91(P <0 .0 5 )。S .pn细胞壁作用A54 9细胞后 ,F actin细胞骨架呈块状、丝状聚集 ,二者间存在剂量依赖关系。结论　S .pn可通过PLC、TPK细胞信号转导途径触发A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,进而导致S .pn侵袭A54 9细胞。     

CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响

目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。     

心脏移植慢性排斥反应机制的探讨

目的：探讨心脏移植慢性排斥反应的发病机制。方法：通过DSBT(Donor Specific Blood Transfusion)诱导耐受，建立同种异体大鼠心脏移植慢性排斥的模型。采用免疫组化和Northern blot方法检测大鼠心脏移植慢性排斥反应时浸润细胞的表型及分布，胞间黏附分子和生长因子的表达。结果：慢性排斥组的心肌CD45^ 、CD4^ 、CD8^ 、TCR^ 、CD45RB^ 细胞、巨噬细胞和NK细胞显著升高。这些细胞主要分布在心肌间质、血管周围和心内膜下区域，并以T淋巴细胞和巨噬细胞为主。在损伤区域可见Ⅰ型细胞间黏附分子(ICAM-1)、Ⅰ型淋巴细胞功能性抗原(LFA-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGE-β1)表达增强。TGF—β1 mRNA Northern blot分析，慢性排斥组比正常对照组升高5～6倍。结论：T细胞和巨噬细胞在心脏移植慢性排斥的损伤中起主要作用，ICAM-1、LFA-1、bFGF和TGE-β1也参与了心脏移植物血管病(Cardiac allograft vasculopaphy，CAV)的形成。     

细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在免疫突触形成中的作用

目的:研究细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-I)在免疫突触形成中的作用。方法:以抗CD3、CD28单克隆抗体活化Jurkat细胞,应用实时荧光定量PCR及流式细胞术检测分析β-1,4-GalT-I的表达变化,激光共聚焦显微镜观察β-1,4-GalT-I在Jurkat细胞活化前后的表达与定位;将Jurkat细胞与SEB负载的Raji细胞共培养以构建Jurkat-Raji细胞免疫突触,观察β-1,4-GalT-I在免疫突触中的定位。结果:β-1,4-GalT-I mRNA表达水平随着Jurkat细胞的活化逐渐增高,在细胞活化后36小时达到高峰;活化后细胞表面β-1,4-GalT-I分子的表达较静止状态高;共聚焦显微镜显示在活化的Jurkat细胞表面及Jurkat-Raji细胞免疫突触部位β-1,4-GalT-I表达信号增强且其分布发生重排和簇集,且与CD3分子共定位,与CD28分子部分共定位。结论:Jurkat细胞表面的β-1,4-GalT-I分子参与了免疫突触的形成。     

ConA对CD4~+CD25~+调节性T细胞早期活化和功能的影响

目的:观察常用丝裂原ConA对CD4+CD25+调节性T细胞抑制功能的影响与早期活化标志CD69之间的关系。方法:用免疫磁珠分离BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-效应性T细胞,加入不同浓度的ConA,12 h后收集细胞,流式细胞术分析其CD69的表达。CFSE标记CD4+CD25-效应性T细胞,按2∶1比例与CD4+CD25+调节性T细胞共同培养,培养同时加ConA,3 d后流式细胞仪分析ConA对CD4+CD25+调节性T细胞抑制CD4+CD25-效应性T细胞增殖的影响。结果:ConA能剂量依赖性地升高CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-效应性T细胞CD69的表达,对两群细胞CD69的升高表现出了相似的作用;另外,ConA在上述浓度能剂量依赖激活CD4+CD25+调节性T细胞的抑制功能。结论:ConA在体外对CD4+CD25+调节性T细胞活化和功能具有促进作用。ConA能一定程度模拟抗原,因而可用于评价药物对调节性T细胞的活化和功能影响。     

CD59-CD2对T细胞信号转导的作用

目的将构建的CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD2分子在T细胞信号转导中的相互作用,探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体,脂质体法转染Jurkat细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,免疫酶法检测转染细胞表面CD59的表达,Western blot检测转染细胞中CD59蛋白的表达;用CD59单克隆抗体作用于各组Jurkat细胞,使用激光共聚焦显微镜检测细胞浆内的Ca2+,ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化,比较各组差异。结果经酶切鉴定证实携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒扩增成功;免疫酶法和Western blot证实CD59在转染细胞中稳定表达,且转染组L-Jurkat细胞比正常组Ju-rkat细胞CD59表达量增加,二者比较其差别有统计学意义(P<0.05);与正常细胞相比,胞浆内Ca2+和IL-2在转染细胞中均高表达,两组细胞比较其差别有统计学意义(P<0.05)。结论 pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体可在Jurkat细胞中稳定表达,CD59mAb交联刺激后,CD59可通过CD2向细胞内传递信号,引起细胞内信号分子的一系列变化,为研究CD59与CD2在T细胞信号转导中的协同作用及进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的机制奠定基础。     

细胞因子调节人肝癌细胞ICAM-1分子的表达及其对CD3AK杀伤功能的影响

应用基因重组人干扰素α（IFN-α）、干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）体外处理人肝癌细胞系H-7402,ABC-CELISA法检测各处理组和对照组细胞表面细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达水平,用 LDH释放法观察CD3单克隆抗体活化的杀伤细胞（CD3AK）对各处理条件下H-7402细胞的杀伤活性。结果表明:经TNF,IFN-α处理的肿瘤细胞ICAM-1表达水平较对照组显著增高,同时对CD3AK细胞的杀伤敏感性亦显著增强,IFN-γ虽能够提高靶细胞ICAM-1分子的表达,但CD3AK的杀伤活性并未因此增强。抗ICAM-1和抗白细胞功能相关抗原LFA-1单抗能够有效地降低CD3AK对靶细胞的杀伤作用,并且能够阻断IFN-α、TNF对CD3AK细胞杀伤效应的促进作用。提示ICAM-1/LFA-1参与了CD3AK粘附杀伤肿瘤细胞过程,TNF、IFN-α的促杀伤效应与肿瘤细胞表面ICAM-1分子的表达水平升高有关。     

跨膜衔接蛋白PAG1棕榈酰化位点突变对CD59介导的Jurkat细胞信号转导的影响北大核心

为探讨跨膜衔接蛋白——富含鞘磷脂的脂膜微区结合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphing-olipid-enriched microdomains 1,PAG1)棕榈酰化位点突变对CD59介导的Jurkat细胞活化、增殖等生物学效应的影响,通过慢病毒转染技术建立PAG1棕榈酰化位点突变的Jurkat细胞株,用CD59单克隆抗体刺激试验组和阴性对照组。用免疫荧光检测PAG1、CD59在细胞上的表达及定位关系;CCK-8法及FACS检测细胞的增殖、凋亡情况;Western blotting检测Jurkat细胞信号转导通路中相关信号蛋白的变化。结果显示,PAG1、CD59分子均定位于细胞膜上且表达位置重叠。棕榈酰化位点突变后,PAG1与CD59分子虽出现点簇状聚集现象,但二者并不重叠。位点突变不影响细胞增殖和凋亡(P>0.05),但CD59单克隆抗体刺激后,细胞凋亡水平显著下降(P<0.05),且TCR活化通路下游分子非受体酪氨酸激酶Fyn、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck)、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLC-γ1)表达均下降。该研究提示,PAG1棕榈酰化位点突变后不能抑制CD59介导的Jurkat细胞增殖。     

LAT介导GPI锚固蛋白CD59对Jurkat细胞的生物学效应研究

目的探讨在T系急性白血病的Jurkat细胞中,GPI类锚固蛋白CD59通过LAT介导的细胞增殖、活化、凋亡等相关的生物学效应,研究GPI锚固类膜蛋白分子对细胞调控的作用方式。方法分别构建LAT-EGFP、neg-EGFP融合蛋白慢病毒载体,转染Jurkat细胞,建立稳定表达株(LAT-EGFP作为实验组,neg-EGFP转染空病毒组作为对照组)。利用CD59单克隆抗体刺激实验组及对照组细胞后,通过CCK-8检测细胞的增殖活性,利用流式细胞术检测细胞凋亡状况,并通过激光共聚焦显微镜观察LAT与CD59分子在细胞中的定位表达。最后利用免疫印迹技术检测细胞内相关信号转导蛋白的表达情况。结果 CD59单抗交联刺激后,细胞增殖活性增加。实验组细胞出现明显晚期凋亡甚至坏死现象。而免疫荧光显示LAT-EGFP组细胞中LAT分子高亮聚集于脂筏区,相较于对照组细胞呈现明显的戒指环状。Western blot显示,CD59抗体交联后,ZAP70、Fyn、LCK的表达均下降且LATEGFP组蛋白表达量低于对照组。结论 GPI锚固蛋白CD59通过T细胞活化连接蛋白LAT对T细胞信号转导发挥正向调控作用,转染LAT-EGFP的Jurkat细胞处于活化状态,LAT呈戒指环状定位于脂筏。     

PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体对小鼠淋巴细胞迁移及分泌趋化因子的影响

目的探讨不同浓度的PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体对Balb/c小鼠淋巴细胞迁移及分泌趋化因子的影响,初步了解这3种刺激剂与小鼠淋巴细胞迁移功能之间的关系。方法通过研磨法分离Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞,用不同浓度的PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体分别刺激培养淋巴细胞,收集细胞上清,用Traswell法测定细胞上清对淋巴细胞迁移率的影响;ELISA法检测细胞上清中趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3、IL-16、IL-8及CCL20的水平。结果 PHA组各个浓度刺激下淋巴细胞的迁移率和对照组无明显差异;ConA组的刺激浓度为20μg/ml时,其对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组;CD3ε单抗组,其浓度分别为2.5、10μg/ml时,对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组。在各个刺激组中,ELISA测得的多种趋化因子水平在总体上存在明显差异。结论 ConA及CD3ε单克隆抗体分别刺激小鼠淋巴细胞后,其分泌趋化因子的功能发生了明显的改变,这些趋化因子影响着小鼠淋巴细胞的迁移功能。趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3的水平明显高于对照,说明这几个因子在淋巴细胞迁移中起到重要的作用。根据实验结果初步推荐CD3ε单抗可以作为小鼠淋巴细胞迁移试验中的首选阳性对照,次选为ConA。     

透明质酸及其受体对细胞运动的作用

透明质酸 (HA)是细胞外基质的主要成分之一。细胞外基质中的HA通过对基质装配产生影响 ,形成多孔性疏松的基质 ,从而促进细胞运动。细胞表面的HA不仅能够介导细胞与基质的初黏附 ,而且在细胞运动时可促进细胞与基质的部分去黏附。细胞内的HA通过与细胞内HA结合蛋白以及信号转导相关的酶相结合 ,作用于细胞骨架 ,调节细胞运动。HA与其受体CD4 4 ,RHAMM或Layilin结合 ,转导信号入细胞内 ,使细胞骨架的构型发生改变 ,并调节与细胞运动有关的蛋白水解酶的合成和释放 ,由此促进细胞的黏附和运动。