水蛭基原探索

水蛭基原根据《中国药典》1995年版 1部为水蛭科动物蚂蟥Whitm ania pigra Whitman ,水蛭 H irude nipponica Whitman或柳叶蚂蟥 Whitmania acranulata Whitman的干燥体共 3种。但目前市售药用商品主要是 Whitmanin属的蚂蟥及柳叶蚂蟥 ,而Hirude属的水蛭较为少见 ,可能因其形体小、采集难、产量低的缘故。上述 3种药材的疗效孰优孰次 ,笔者试从其药理及历代文献诸方面对基原进行讨论。1　基原品种1.1　水蛭科动物蚂蟥又名宽体金线蛭 ,体长大 ,略呈纺锤形 ,扁平 ,长 6～ 13cm,宽 0 .8～ 2 .0 cm,背部通常暗绿色 ,腹部淡黄色 ,杂有许多不…     

基于ITS序列的中国药用石斛及其混伪品的分子鉴定

目的:通过测定17种药用石斛的rDNA ITS全序列,构建分子系统树,在分子水平对待检种进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.方法:采用改良的CTAB法提取石斛叶片DNA,PCR扩增rDNA ITS区全序列,产物回收纯化后直接测序,运用Bioedit,MEGA 4.0等软件分析石斛属植物的rDNA ITS序列的特征.结果:建立了17种药用石斛rDNA ITS区碱基全序列数据库,其中,ITSl的长度为228～234 bp,GC量为45.7%～53.0%,变异位点167个,占总位点67.34%,信息位点106个,占总位点42.74%;ITS2长度为241～247 bp,GC量为44.8%～55.7%,变异位点165个,占总位点66.27%,信息位点115个,占总位点46.18%.属间的遗传距离为0.295,石斛种间的平均遗传距离为0.142,种内各居群间的平均遗传距离为0.002.结论:利用17种石斛的全序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种rDNA ITS区进行序列测定,可以在分子水平对石斛不同种质进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.     

基于性状鉴别和DNA条形码联用的虎尾海马生药学研究

目的:采用性状-线粒体COI条形码联用的方法对市售海马药材伪品虎尾海马Hippocampus comes进行生药学研究,提供主要海马药材伪品虎尾海马的性状和分子的鉴定特征,为海马药材的鉴定提供新方法。方法:利用外观性状鉴别方法对虎尾海马典型性状特征进行研究;扩增获得虎尾海马样品的COI条形码序列,比较各序列的碱基组成、GC含量、变异率等,分析虎尾海马与常见海马药材的正品和伪品序列,明确其种内和种间遗传距离;利用NJ(neighbor-joining)法构建虎尾海马与常见海马样品的系统进化发育树,分析其亲缘关系。结果:虎尾海马最典型性状鉴别特征为尾部有交替出现的花斑,头冠低小且有5个显著的圆形突起;虎尾海马样品的COI序列长度为649 bp,碱基GC平均含量为39.73%,种内的平均遗传距离为0.001 1,其种内遗传距离远小于与另外8种海马药材的种间遗传距离,存在显著的条形码间隔;NJ系统发育树显示虎尾海马与其他海马药材各自聚为一支,其分支支持率为100%,与刺海马的亲缘关系最近。结论:基于性状鉴别-线粒体COI条形码的生药学研究方法能够准确鉴定虎尾海马,与其他海马进行准确区分,为虎尾海马的快速鉴定提供了新的手段,对改善市售海马混乱的流通现状、控制和提高海马药材质量具有重要意义。     

白芷药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定

目的:应用ITS2序列对白芷、杭白芷及其混伪品进行鉴定研究,为白芷药材的准确鉴定提供依据。方法:提取样品总DNA,扩增ITS2序列并双向测序,计算种间、种内Kimura-2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统邻接(NJ)树。结果:白芷的ITS2序列长度为227 bp,平均GC含量为55. 05%,种内最大K2P遗传距离为0. 009 2;杭白芷ITS2序列长度均为227 bp,GC含量为55. 07%,种内无变异位点。白芷与杭白芷种内最大遗传距离均远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离。NJ树结果显示白芷与杭白芷聚为一支,可与其他混伪品明显区分开。结论:ITS2序列能有效地鉴定白芷药材及其混伪品,为白芷药材市场流通管理及临床用药安全提供了新的技术手段,也为其他中药材及其混伪品的鉴定提供参考。     

保康柴胡5S-rDNA间隔序列分析及道地性研究

目的探讨保康柴胡道地性形成的基因基础。方法提取6个柴胡样品的总DNA,进行5S-rDNA间隔序列的PCR扩增和测序,用Mega3.0软件进行序列分析,采用RP-HPLC法测定柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量。结果柴胡样品的5S-rDNA间隔序列具有相似的碱基序列,长度为270~321bp,G+C%含量为30.7~36.5%,各样品柴胡皂苷a、d的含量有所不同。结论种间5S-rDNA间隔序列差异大于种内,道地药材之间的遗传距离较小,6种柴胡品质的差异可能与碱基序列有关。     

我国不同地区白木香核糖体DNA内转录间隔区碱基序列分析

目的:研究我国不同地区白木香核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)碱基序列的差异。方法:运用PCR法对白木香的ITS(包括ITS1,5.8S,ITS2)序列扩增后直接测序,用软件CLUSTALX和MEGA分析测序结果。结果:白木香ITS区总长度为680bp,其中ITS1为246bp,5.8S为163bp,ITS2为271bp。ITS序列在白木香种内的变异很小,只有6个变异位点,种内遗传距离为0.0%-1.1%。结论:ITS序列的差异为鉴别不同产区白木香及其近缘种提供了依据。     

不同产地大黄ITS序列分析

目的:建立不同产地大黄的分子系统学基础,为大黄的基源鉴定和品质评价提供分子依据。方法:采用PCR技术获得ITS基因,进行测序,经软件进行统计分析,计算各样本间的遗传距离并建立系统树。结果:大黄ITS序列G+C含量较高,达66.55%～68.49%,8个样品ITS(包括5.8s)序列的长度范围为562～568。所有样品5.8srDNA高度一致,除DH5样品有两个位点的碱基转换外,其余无碱基差异。结论:ITS序列特征可以作为大黄种间鉴别的有效分子标记,药用大黄在属内与其它种关系较远。     

不同温度和pH对蚂蟥消化道酶活性影响的初步研究

目的:测定和比较不同温度和pH条件下蚂蟥Whitmania pigra消化道内淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶的活性.方法:实验设计了从7～ 52℃10个温度梯度,pH从2.2 ～11.2共10个梯度,测定不同温度及pH条件下蚂蟥消化道内淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活力的变化.结果:当温度在7 ～52℃,pH2.2～11.2,蚂蟥消化道内脂肪酶在温度为37℃,pH为8.2时酶活最大;淀粉酶在温度为37℃,pH为5.2时酶活最大;蛋白酶在温度为42℃,pH为3.2,9.2时酶活较大.结论:蚂蟥消化道内脂肪酶的最适温度为37℃,最适pH为8.2;淀粉酶最适温度为37℃,最适pH5.2;蛋白酶最适温度为42℃,最适pH为3.2,9.2.     

中国不同地区绞股蓝ITS序列分析

目的 比较中国不同地区绞股蓝的nrDNA ITS碱基序列的差异,以期分析绞股蓝的地理分布与ITS基因型的相关性,为我国不同地区绞股蓝的鉴别提供分子依据.方法 PCR克隆测序,MegAlign(DNASTAR)软件对序列进行对位排列,PAUP4.0b10软件进行系统发育分析,构建最大简约树.结果 绞股蓝ITS区长度为658～659 bp,变异位点为8.48%,信息位点为2.72%.不同地区的样品在碱基的量、信息位点的碱基位置和遗传距离等方面存在一些差异.系统发育分析表明ITS基因型与绞股蓝的地理分布具有一定的相关性,但也有部分不一致,可能主要是因为纹股蓝种内复杂的倍性.结论 ITS序列可作为中国不同地区绞股蓝的一种良好的分子标记,而要确定不同地区的绞股蓝合理的亲缘关系还需要结合其他方面的证据.     

水蛭的临床运用和实验研究概要

水蛭为环节动物水蛭科,日本水蛭Hirudoni—pponica Whitman和宽体金线蛭whitmania pigra或尖细金线蛭Wacranulata等的全体。 其生长于全国大部分地区、栖息水田、湖沼中。性辛,味或有小毒。具有破血、逐瘀,通经作用。 1 药理研究 实验中张氐等发现水蛭含有蛋白质,其水解氨基酸含量达49.4％,富含人体必需氨基酸、谷氨酸含量高达8.3％。另含铁、锰、锌等多种人体必需的微量原素。中国药用动物志协作组报道新鲜水蛭的唾液中含有一种抗凝物质——水蛭素(Hirll—din)     

一种钩藤属植物的分子鉴定

目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对1种钩藤属植物归类到种提供分子证据.方法:改良CTAB法提取钩藤植物材料总DNA,通过引物对rDNA ITS区序列进行PCR扩增,经过克隆、测序后,与GenBank中已有的钩藤属植物rDNA ITS区序列进行比对,并应用Clustal X,BioEdit等软件计算分析,用PAUP软件构建系统发育树.结果:测序得到该钩膝植物的rDNA ITS区序列长度为719bp,序列分析结果显示该钩藤植物与Genbank中已有的华钩藤Uncaria sinensis rDNA ITS区序列之间相似性达99.7%,并且在系统发育树中并排聚类成一支.结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对该钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据.     

地黄资源遗传多样性分析

目的:研究不同地区栽培地黄及野生地黄品种间ITS序列差异,为地黄的系统发育和分子鉴定提供依据。方法:用CTAB法提取地黄叶片中总DNA,对PCR产物进行克隆测序,采用MEGA4.0进行系统进化分析。结果:各供试地黄的ITS区序列总长度为613~614 bp,长度变异仅1 bp,其中ITS1长度为224~225 bp,G+C占60.4%~63%;ITS2长度为224~225 bp,G+C占57.1%~65.3%;5.8S长度高度保守,均为164 bp。系统发育分析表明:北京2号地黄与其他地黄资源差异性较大,亲缘关系较远。野生地黄居群内差异较小,居群间没有差异。河南栽培地黄与山西、山东省栽培地黄间没有差异;野生地黄资源中神农山和青天河一带地黄与山东省栽培地黄亲缘关系最近,而河南栽培地黄和山西省栽培地黄与野生地黄没有差异。结论:不同地区地黄资源种间亲缘关系较近,系统分化不明显。     

一株分离自新疆细虫草菌核的弯颈霉鉴定及抑菌研究

目的：开发利用新疆细虫草资源,为新疆细虫草相关真菌的研究和开发利用提供基础资料。方法：研究从新疆细虫草菌核中分离得到一种白色菌株,编号为SFYT002,采用形态学观察和ITS以及18SrDNA测序,在GenBank比对,进行系统进化树分析,并采用滤纸片法研究其体外抗菌作用。结果：菌株SFYT002主要的特征为菌落白色棉绒状,瓶梗长在分枝的分生孢子梗上,瓶梗基部膨大,顶部急剧变细,部分颈部弯曲,孢子小且透亮,孢子有出芽现象,常形成聚集孢子头,分生孢子球形,亚球形至椭圆形。ITS和18SrDNA序列分析表明,弯颈霉属为单系发生,菌株SFYT002与膨大弯颈霉聚为一支。研究其抑菌作用表明,菌株SFYT002发酵液及其不同极性的提取物对4种常见致病菌,均有很强的抑制作用。结论：通过形态学和分子生物学特征将菌株SFYT002鉴定为膨大弯颈霉,具有较强的抑菌活性。     

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力。方法:选择psbA-trnH,rbcL,matK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcod-ing gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力。结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6%,83.6%,96.4%,98.2%,其鉴定成功率除rbcL为77.8%,75.9%外都为100%,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势。ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5%,87.6%。结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合。     

基于ITS2条形码鉴定柴胡与大叶柴胡

为准确鉴定柴胡与大叶柴胡,该研究共48份柴胡、大叶柴胡药材,扩增ITS2 序列并进行测序,采用CodonCode Aligner软件进行序列拼接,用软件MEGA5.0分析比对确定不同的单倍型,并基于K2P模型进行遗传距离等分析。采用相似性搜索法、最近距离法、构建邻接树（NJ树）法对柴胡与大叶柴胡进行鉴定。结果显示柴胡与大叶柴胡种间最小K2P距离为0.049,远远大于柴胡种内最大K2P距离0.013。NJ树显示大叶柴胡独自聚为一支,可明显与柴胡区分。因此应用ITS2条形码可以准确鉴定柴胡及大叶柴胡。     

不同产地野生和人工养殖蚂蟥内在质量比较研究

目的:探讨不同产地蚂蟥的内在质量差异性,为新品种筛选提供理论依据。方法:参考《中国药典》(2005年版)一部测定不同产地水蛭药材的水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性,采用高效液相色谱法测定其黄嘌呤,次黄嘌呤含量。结果:江宁试验基地人工养殖品种在醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性、黄嘌呤、次黄嘌呤等含量上均相对高于其他种群,浙江桐乡基地大面积养殖品种多项指标高于野生品种。结论:经过人工育苗、养殖的蚂蟥品质优良,建议大面积推广养殖。     

中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨

该文通过系统地本草文献梳理与研究指出,传统中医使用的水蛭是生于水中,个头较小且能吸食人及牛马血的水蛭.具有这些特性的水蛭的品种有日本医蛭Hirudo nipponia Whitman、丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis sp.Nov.、菲牛蛭P.manillensis (Lesson)以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang 5个品种,与2010年版《中国药典》水蛭项下所规定的动物品种来源不完全一致.建议《中国药典》修改并补充水蛭的品种来源,保留原有日本医蛭H.nipponica Whitman,增补菲牛蛭P.manillensis (Lesson),暂时保留宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、尖细金线蛭W.acranulata Whitman,并进一步加强丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭P.nanjingensis sp.Nov.以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang的化学成分和药理作用以及资源分布的研究,以待作为药用品种补充.     

基于ITS2条形码SNPs的人参和西洋参PCR-SSCP分子鉴别研究

目的:依据人参和西洋参ITS2条形码的专属性SNP鉴别位点,建立利用PCR-SSCP技术鉴别人参和西洋参的方法.方法:查找GenBank上已收录的人参和西洋参ITS2序列,进行比对分析,筛选人参和西洋参ITS2序列的专属性SNP鉴别位点,据此设计引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对11个人参样品和10个西洋参样品进行分析,对PCR产物进行测序验证.结果:人参和西洋参样品的PCR-SSCP谱带与各自的对照药材谱带一致,人参和西洋参的PCR-SSCP谱带有显著差异;PCR-SSCP鉴别结果和经测序鉴别结果一致.结论:和测序法相比,PCR-SSCP方法快速、准确,可用于人参和西洋参药材的鉴定.     

基于ITS2序列的清风藤属药用植物分类鉴定研究＊

目的 探讨核基因内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列在清风藤属（Sabia）药用植物中的分类鉴定可行性与系统关系。方法 对9种38个产地的清风藤属药用植物ITS2序列进行PCR扩增和测序。基于（Kimura 2-parameter）K2P计算遗传距离，分析种内和种间变异与鉴定效率，应用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。结果 清风藤属药用植物ITS2序列长度均为241 bp，GC含量为51.9-64.7%。38个产地清风藤属药用植物ITS2序列，共具有保守位点168个，变异位点数目为73个，简约信息位点数目为65个。ITS2在清风藤属药用植物中的种内变异为0-0.074，种间变异为0.007-0.205，种间变异较小，种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉，没有形成明显的间隔。ML系统树表明，属内种间具有较高的自展支持率，基本能单独聚成一支，可对清风藤属药用植物种间进行有效分类鉴定。结论 ITS2序列在清风藤属植物中具有较好的通用性与鉴定效率，可用于清风藤属DNA条形码与分类鉴定研究。本研究为清风藤属植物的分类鉴定与系统演化研究提供了一定参考。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。