重组痘苗病毒嵌合巨蛋白的免疫学研究

目的　pSFJ1 6与pSFJ38均是以牛痘病毒包涵体 (ATI)启动子和分别串联的 1 6个和 38个p7 5突变型早期启动子为基本构件组成的复合型启动子 (ATI-p7 5)、痘苗病毒复制非必需区血凝素 (HA)基因为侧翼的痘苗病毒表达载体。分别插入编码艾滋病病毒 (HIV - 1 )外膜蛋白env、核心蛋白gag与编码干扰素 (IFNα - 2b)基因 ,观察其表达产物诱导的机体内产生抗体效价的变化规律。方法　利用分子克隆技术构建重组质粒 ,经脂质体转染与野生型痘苗病毒在Cos- 7细胞内同源重组 ,筛选、纯化、获得重组痘苗病毒vJ1 6env/IFNα - 2b和vJ38gag/IFNα - 2b。免疫小鼠后 ,经间接ELISA分折免疫小鼠血清抗体的OD4 90 值变化。结果　免疫小鼠后体内抗体的OD4 90 值 ,实验组与阴性对照组平均数有显著性差异 (P <0 0 5) ,实验组与阳性对照组之间无显著性差异 (P >0 0 5)。结论　重组痘苗病毒vJ1 6env/IFNα - 2b和vJ38gag/IFNα- 2b免疫小鼠后可诱导机体产生高滴度的抗HIV - 1env、gag与IFNα - 2b巨蛋白抗原的抗体 ,蛋白稀释度与血清抗体OD4 90 值呈负相关     

Gag/IFNα-2b融合基因在痘苗病毒中共表达研究

目的　本实验将编码AIDS病毒 (HIV -1)核心蛋白gag与编码干扰素 (IFNα -2b)基因插入以痘苗病毒复制非必需区血凝素 (HA)基因为侧翼 ,牛痘病毒包涵体 (ATI)启动子和串联的p7 5突变型早期启动子为基本构件的痘苗病毒表达载体 (pJ3 8) ,经与野生型痘苗病毒在细胞内同源重组 ,获得具有生物活性的重组痘苗病毒vJ3 8gag/IFNα -2b。方法　经免疫荧光、Dot -ELISA、SDS -PAGE、Western -blot等方法检测表达产物 ,分析免疫小鼠后血清抗体IgGOD4 90 值与T淋巴细胞的变化。结果　vJ3 8gag/IFNα -2b能表达Gag/IFNα -2b融合蛋白 ,分子量约 60kDa。免疫小鼠实验表明血清抗体IgGOD4 90 值、CD+ 4、CD+ 8T淋巴细胞计数的组间比较 (P <0 0 0 1) ,含IFNα -2b与单纯vJ3 8gag组相比 (P >0 0 5) ,但呈渐进性增高的趋势。 结论　重组痘苗病毒表达的gag/IFNα -2b融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性     

重组痘苗病毒免疫小鼠的实验研究

目的　观察艾滋病病毒外膜蛋白、核心蛋白与干扰素 (HIV -lenv/IFNα- 2b、HIV - 1gag/IFNα - 2b)融合基因的表达产物 ,能否作为理想的基因疫苗 ,使机体产生体液免疫和细胞免疫应答。方法　以小鼠为实验对象 ,用重组病毒vJ16env/IFNα - 2b、vJ38gag/IFNα - 2b免疫小鼠 ,以生理盐水和野生型痘苗病毒为对照组 ,检测小鼠外周血与脾淋巴细胞对ConA、Lps的反应性。用间接ELISA试验检测了重组病毒诱导小鼠产生的HIV -lenv/IFNα - 2b、HIV -lgag/IFNα - 2b抗体 ,用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD 4 、CD 8T细胞计数。结果　外周血与脾淋巴细胞对ConA、Lps的反应性 ,实验组与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。vJ16env/IFNα - 2b与vJ38gag/IFNα - 2b能激发小鼠体内产生高滴度的抗体。CD 4 、T淋巴细胞与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。CD 8T淋巴细胞与对照组比较无差异性 ,但呈增高趋势。结论　重组痘苗病毒能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫。重组痘苗病毒能在体外与HIV -lenv和HIV - 1gag阳性血清发生特异性反应 ,具有免疫原性和免疫反应性。     

HIV Ⅰ型外膜蛋白/干扰素A-2b的构建与表达

目的 构建艾滋病病毒外膜蛋白（env）与干扰素（IFNα-2b）融合基因表达质粒，观察其在痘苗病毒中共表达结果。方法 利用基因重组技术，将IFNα-2b基因片段插入到env基因的nt8383位点，经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选，挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、免疫印迹（Western blot）和斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）鉴定表达产物。结果 间接免疫荧光实验结果显示，转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Westem-blot与Dot-ELISA结果均显示，重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的env／IFNα-2b蛋白。结论 成功地构建了重组真核细胞表达质粒，表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

HIV-1 gag/IFNα-2b表达产物的免疫原性研究

目的构建艾滋病病毒核心蛋白（gag）与干扰素（IFNα-2b）融合基因表达质粒,观察其与痘苗病毒共表达的结果,研究其意义。方法利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt 531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组病毒。经免疫荧光、蛋白印迹分析（Western blot）和斑点酶联免疫（Dot ELISA）鉴定表达产物。结果间接免疫荧光实验显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot ELISA结果均显示,转染重组质粒的细胞裂解物中存在表达的gag/IFNα-2b蛋白。结论成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

HIV-1 AE重组型疫苗构建及免疫原性研究

目的利用AE亚型的膜蛋白,研发抗HIV-1AE重组型的疫苗并进行免疫原性评价。方法构建表达中国流行株97CNGX2F（HIV-1 AE2F）包膜蛋白gp140的重组痘苗病毒rVVT140AE。使用表达gp140的DNA疫苗和rVVT140AE用初免-加强方式免疫小鼠。免疫结束后第2周处死小鼠,分别检测特异性抗体滴度和特异性T细胞反应。结果本疫苗所活化的特异性抗体滴度在3 200和51 200之间,几何平均值为11 143;总T细胞免疫反应强度为（1 918±442）SFCs/10^6脾细胞,其中针对env1、env2、env3、env4肽池的免疫反应强度分别为（1 280±330）SFCs/10^6脾细胞,（66±16）SFCs/10^6脾细胞,（163±34）SFCs/10^6脾细胞和（409±96）SFCs/10^6脾细胞,均显著高于空载体对照组（〈10 SFCs/10^6脾细胞）。结论本实验构建的HIV-1 AE2F株包膜蛋白gp140重组痘苗病毒疫苗可作为针对我国HIV-1流行株的候选疫苗免疫原。     

rBCG-HPV16L1-E7疫苗的构建和免疫原性研究

[目的]构建以BCG为载体的rBCG-HPV16L1-E7疫苗,研究rBCG-HPV16L1-E7重组表达体嵌合乳头状瘤病毒样颗粒（VLPs）对小鼠免疫功能的影响,初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤（宫颈癌）的预防作用.[方法]电穿孔法将pIJ702-HPV16L1-E7分泌型穿梭表达质粒导入BCG中表达,构成rBCG-HPV16L1-E7疫苗.Western blot检测E7蛋白的表达.采用rBCG-HPV16L1-E7疫苗皮下注射于C57BL/6小鼠,^51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性（cytotoxic T lymphocyte,CTL）,ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体和细胞因子的表达水平.[结果]Western blot法分析证实,该重组疫苗能特异地表达HPV16 E7蛋白.以rBCG-HPV16L1-E7免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2、IFNγ及E7抗体的含量明显升高,诱导机体产生特异的抗体反应以及CTL反应.[结论]rBCG-HPV16L1-E7能增强小鼠的细胞和体液免疫反应,可作为HPV16预防性疫苗.     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1的克隆表达及抗体制备

目的克隆表达Ⅱ型登革病毒（dengue virus 2，DV2）非结构蛋白1（DV2-NS1）基因，并制备其单克隆抗体。方法提取Ⅱ型登革病毒的RNA，扩增其NS1全长基因片段。经TA克隆将NS1基因克隆至pQE30载体中进行诱导表达，表达产物经变性处理后用Ni柱亲和层析纯化并复性，经免疫印迹法（Western Blot）鉴定抗原性。用复性后的NS1蛋白和灭活Ⅱ型登革病毒交替免疫Balb／c小鼠。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞经间接ELISA法、间接免疫荧光法（IFA）进行单抗亚类、特异性的筛选与鉴定。结果携带重组质粒pQE30／DV2-NS1的菌株经诱导，可高效表达重组DV2-NS1蛋白，经复性获得可溶性蛋白，Western Blot证实重组的DV2-NS1蛋白具有抗原性；用重组蛋白和病毒混合免疫，共获得10株抗NS1蛋白的单抗，其中3株为特异性抗DV2-NS1蛋白，与其他3型登革病毒无交叉，另7株为混合交叉型；亚类分析一株为IgG2b，余为IgG1。结论获得重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1，并得到10株抗DV2-NS1蛋白的杂交瘤细胞株，为进一步研究NS1的生物学特性和临床诊断试剂建立奠定了基础。     

空肠弯曲菌peblA基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的：克隆空肠弯曲菌peblA基因，构建其原核表达载体；鉴定重组表达产物的免疫原性。方法：PCR扩增空肠弯曲菌peblA基因，构建pET-28a（＋）-peblA表达载体。转化E coli BL21（DE3）后诱导表达，用SDS—PAGE鉴定表达产物。采用Ni—NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEBl。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEBl免疫反应性，双向免疫扩散试验鉴定rPEBl免疫家兔的抗血清效价。结果：所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99．9％，转化E coli BL21（DE3）后，表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33％左右，纯化后获得纯度为96％的重组蛋白。Western blot证实rPEBl能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEBl血清的双向免疫扩散效价为1：16。结论：成功地构建了高效表达载体pET-28a（＋）-peblA，并获得rPEBl，所表达的rPEBl具有良好的免疫原性和免疫反应性，为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的：制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法：重组SARS病毒N蛋白免疫BALB／c雌性小鼠获得免疫脾细胞，利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2／0细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果：获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论：制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。     

干扰素α—2b抗体表达及其对乙型肝炎治疗效果的影响

[目的]了解乙型肝炎病人应用于干扰素（IFNα-2b)治疗后,产生干扰素抗体（IFNα-2b抗体）情况及其对治疗的影响。[方法]乙肝病人（HB eAg、HBV DNA均阳性）应用于干扰素治疗前及治疗后30、60、90d时分别采取空腹静脉血迹行NFα-2b抗体、HBeAg及HBV DNA检测。[结果]55例病人治疗后90d时共查到干扰素抗体阳性20例,阳性率为36．4％。干扰素抗体阳性病人治疗结束时,HBeAg阴转率、HBV DNA阴转率均为25％（5／20）;干扰素抗体阴性组病人HBeAg阴转率为57％（20／35）,HBV DNA阴转率为54％（19／35）。两组的差异有统计学意义（X^2＝5．3、4．4,P＜0．05）。[结论]干扰素治疗后,部分病人 可以产生干扰素抗体,并可减弱干扰素的抗病毒作用。     

汉坦病毒全NP蛋白及其型特异区编码基因的克隆及表达

目的：开发简单、可靠的HTN、SEO型血清学分型检测方法。方法：应用RT－PCR法对全NP蛋白基因及其型特异区基因进行扩增，经TA克隆及Cui-SS、Cui-155杆状病毒载体的构件、转座、获重组杆状病毒，再感染Sf9细胞进行表达。结果：克隆与表达了SEO病毒NP蛋白的全蛋白编码区及型特异编码区（155到429氨基酸处的编码基因），全NP蛋白表达产物与病毒株感染VeroE6细胞的反应谱完全一致，型特异区表达产物与相应的型特异McAb结合。结论：建立了SEO型病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆和表达方法，为开发简便、可靠的SEO型血清学分型检验方法奠定了基础。     

SEO型汉坦病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆、表达

目的：开发简单、可靠的HTN、SEO型汉坦病毒血清学分型检测方法。方法：应用RT－PCR法对全NP蛋白基因及其型特异区基因进行扩增，经TA克隆及Cui-SS、Cui-155杆状病毒载体的构件、转获重组杆状病毒，再感染Sf9细胞进行表达。结果：克隆与表达了SEO病毒NP蛋白的全蛋白编码区及型特异编码区（155到429氨基酸处的编码基因），全NP蛋白表达产物与病毒株感染Vero E6细胞的反应谱完全一致，型特异区表达产物与相应的型特异cAb结合。结论：建立了SEO型病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆和表达方法，为开发简便、可靠的SEO型血清学分型检验方法奠定了基础。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs原核表达载体的构建与表达

摘要:目的　利用大肠杆菌原核表达系统表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）NSs重组蛋白。方法　采用RT-PCR技术,从SFTSV毒株提取的病毒总RNA中,扩增NSs全长基因,将其克隆至pET22b（+）中构建原核表达载体pET22b-NSs,经酶切及测序鉴定后转化表达菌BL21（DE3）,IPTG诱导,通过Western Blot鉴定NSs蛋白的表达。结果　酶切、测序证明重组原核表达载体pET22b-NSs构建成功,免疫印迹法可见NSs基因编码蛋白表达。结论　实现了发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒NSs蛋白的结构与功能奠定了基础。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究.方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65 ～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205 -HPV16△L2,转化大肠杆菌BL21( DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达.表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性.结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性.结论:成功将HPV162表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达.     

单周期复制的马传染性贫血病毒重组疫苗的构建

目的 构建单周期复制的马传染性贫血病毒（EIAV）重组疫苗。方法 将感染性EIAV分子克隆WU57囊膜（env）基因敲除，在pGPT中克隆4个拷贝的Mason Pfizer猴病毒组成性RNA转运因子（CTE），构建重组质粒pGPTC；构建另一表达Env蛋白的重组质粒pTEB，并分别与重组质粒pGPT、pGPTC共转染进入293细胞；以Western blot对转染细胞外培养液进行检测以鉴定病毒粒子的产生；通过免疫荧光分析鉴定感染细胞内病毒蛋白的表达。结果 pGPTC/pTEB共转染的细胞外培养液中检测到特异性EIAV病毒蛋白，而pGPT／pTEB共转染的细胞外培养液中没有检测到特异性EIAV病毒蛋白。转染细胞产生的病毒粒子EIAVGPTC。感染的原代马肾细胞（EK）内检测到病毒蛋白的表达，而用感染细胞产生的病毒粒子再感染EK细胞，则无病毒蛋白表达。结论 Rev/RRE对于病毒结构蛋白的表达是必需的；CTE可以替代Rev蛋白功能辅助EIAV结构蛋白的表达；转染的293细胞产生了EIAV病毒粒子并分泌到胞外培养液中；产生的病毒粒子EIAVGPTC是一复制缺陷的活重组病毒。     

人类免疫缺陷病毒

2883 Hw一1外膜(e:、v)基因在重组痘苗病毒中的高效表达金宁(长春畜牧大学兽医研究所)…病毒学报/中国微生物学会一l的4,10(4、一307~332 应用重组痘苗病毒作载体.主八T【、P::突变型早期启动子控制下.高效表达了(经定点突变去除一处早期终止信号的)Hlv一1 env墓因。经认。、:ern blor证H)J.晚期启动子活性强的psFJZ一38能更高效地表达en、·基因。经L。n.i一Leotin提取以及sDs一P、oE后的激光扫描测定结果.在1。·个感染细胞中可产生50一70L‘s的En、蛋白。2886体内Hlv一1含量的定量检测[综述」曹韵贞(艾依戴蒙AIDs研究中心),国外…