津白Ⅱ小鼠自发乳腺癌病理相关特征分析

目的:观察并分析津白Ⅱ小鼠自发乳腺癌病理相关特征。方法:从2005年3月～2006年10月共收集津白Ⅱ自发乳腺癌小鼠59只,记录其发瘤时间、生产次数、发瘤部位、发瘤数目,并对肿瘤组织进行病理学检查以确定肿瘤的性质。结果:59只津白Ⅱ自发乳腺癌小鼠的发瘤时间平均为330d,生产次数平均为2.7次,肿物的好发部位依次为左下腹、左前胸、右前胸、右下腹及颈背部。有12只小鼠的肿物是多发的,其余均为单发,经病理证实其多为乳腺腺癌。结论:津白Ⅱ小鼠经过长期的连续传代后其自发乳腺癌的特征与以前的报道有所差异。     

噬菌体展示技术筛选小细胞肺癌细胞特异性结合多肽

目的 利用噬菌体七肽库,筛选出与小细胞肺癌细胞系H446细胞特异性结合的多肽。 方法 利用噬菌体展示技术和小细胞肺癌细胞系H446细胞,经过多次3轮筛选,每次挑取12个噬菌体单克隆进行DNA测序,分析得到多肽序列,并利用免疫组织化学技术验证多肽的特异性。 结果 多肽AF(AGALHQF)与小细胞肺癌病理组织有较高的亲和性。 结论 噬菌体展示技术筛选的多肽AF可望为小细胞肺癌靶向治疗提供新的方向。     

从噬菌体肽库中筛选并鉴定CD13特异性结合肽

目的 筛选并鉴定可和单核细胞表面CD13分子特异性结合的特异性短肽.方法 以CD13为靶分子,用噬菌体展示十二肽库进行筛选,通过亲和富集法筛选表达有特异性结合肽的噬菌体,ELISA鉴定所挑选噬菌体和CD13的亲和力,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列.对筛选到的并经比对分析认为有生物学特性的多肽进行人工合成,通过免疫荧光技术检测多肽和THP-1细胞的结合情况、位置及WM15对多肽和细胞结合的阻断作用.结果 经过四轮筛选,与CD13特异性结合的噬菌体得到有效富集并最终接近饱和状态.第4轮筛选后回收率与第1轮相比,富集了30倍.挑取的20个噬菌体单克隆中,经ELISA鉴定有10个和CD13的亲和力较高,有阳性意义.经比对得到2个有生物学功能的多肽序列P9、P7,它们分别和人巨细胞病毒(HCMV)UL38、UL105基因编码的相应氨基酸序列有83%、100%相似性.免疫荧光检测可见多肽P9、P7和THP-1细胞的结合位于细胞膜表面.WM15可以不同程度的阻断多肽和细胞的结合.结论 成功筛选出了2条可和CD13特异性结合的短肽P9、P7,而且P9、P7可以和THP-1细胞膜表面的CD13分子特异性结合.     

利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽

目的：将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽。方法：用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体,通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序。结果：经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果。从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑（阳性克隆）进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS。结论：从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础。     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定

目的:通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定.方法:以L-02为阴性消减细胞,HepG2为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选.并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性.人工合成短肽HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性.结果:4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集.所挑取的26个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生5条氨基酸序列.经BLAST分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子.ELISA分析鉴定显示,5个阳性克隆在HepG2和L-02细胞上有差异性结合,其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大.免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞.免疫荧光显色证实,FITC-HBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质.结论:H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

Screening of specific binding peptide targeting to blood vessel of human esophageal cancer using phage display C7C peptide library in vivo

AIM: Identify the candidate peptides used for anti-angiogenic therapy of esophageal cancer by in vivo screening C7C peptide library for peptides binding specifically to blood vessels of human esophageal cancer. METHODS: The phage displayed C7C peptide library was injected intravenously into mice bearing human esophageal tumor xenografts under renal capsule. After 5 rounds of screening, 13 clones were picked up individually and sequenced. During each round of screening, titers of phage recovery were calculated from tumor xenograft and control tissues. Homing of these 9 peptides to tumor vessel was detected by calculating phage titers in the tumor xenograft and control tissues(lung and spleen) after each phage was injected into mice model, and compared with the distribution of phage M13 and Ⅷ-related antigen in tumor xenograft by immuno- histochemical staining. Comparisons among groups of data were made using one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Bonferroni multiple comparisons test. RESULTS: The number of phage recovered from tumor tissue of each round increased gradually and the number of the fifth round was about 10.63 folds than it is in the first round (P<0.01). At the same time, the titers of spleen and lung used as control tissues decreased (P<0.01in spleen & P<0.05 in lung) by using analysis of variance of repeated measurement data. Immunohistochemical staining showed similar staining pattern with M13 antibody or Ⅷ-related antigen antibody, suggesting that phages displaying the selected peptides could home to blood vessel of human esophageal cancer. According to their DNA, 9 corresponding peptide sequences were deduced. And the homing ability to blood vessel of phages displaying the selected peptides was confirmed by comparing with their recovery in tumor and control tissues There was significant statistical difference in sequence YSFNSWM,PNPNNST,YSINDWH,LPAMPNS,YPTPYDI ,PMNADNL,SRHDLNS and STVATSQ between tumor group and the two control group as using analysis of variance. Two motifs,YSXNXW and PXNXXN,were also obtained by analyzing the homology of these peptide sequences. The staining distribution of phage with the sequence of PNPNNST was similar to that of the blood vessel marker Factor Ⅷ-related antigen staining. After sequencing, each phage with the selected peptide of PNPNNST with 1011 pfu was injected intravenously into mice. The homing ability to tumor vessel of these 9 kinds of peptides in the xenograft was higher than control tissues(lung and spleen). CONCLUSION: Nine peptides obtained from in vivo screening homed to the blood vessel of human esophageal cancer, and the two motifs of YSXNXW and PXNXXN are the possible biochemical recognition units binding to vascular endothelial cells of esophageal cancer. CONCLUSION: Nine peptides obtained from in vivo screening homed to the blood vessel of human esophageal cancer, and the two motifs of YSXNXW and PXNXXN are the possible biochemical recognition units binding to vascular endothelial cells of esophageal cancer.     

人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析

目的: 利用噬菌体随机环七肽库在小鼠肾包膜下荷人胃癌模型体内筛选能够与人胃癌血管内皮细胞结合的特异性分子,对其多肽进行计算机空间结构模拟分析. 方法:制备免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型,用随机环七肽库在其体内进行4轮筛选,对随机获得的14个克隆进行测序. 通过细胞ELISA检测所得到的特异性小肽在脐静脉内皮细胞(HUVEC),SGC7901,LoVo,Eca-109及Hep-G2细胞系上的结合能力. 并通过计算机分子模拟多肽CGNSNPKSC的空间结构. 结果:成功获得14个噬菌体克隆,并呈现出2种氨基酸序列,其中多肽CGNSNPKSC,相比于对照细胞SGC7901, LoVo, Eca-109, Hep-G2,其同HUVEC结合能力明显增强. 利用计算机技术成功地模拟并分析了该多肽的空间结构. 结论:多肽CGNSNPKSC同血管内皮细胞结合能力较强;空间结构稳定,是一个高亲水多肽,更容易形成折曲的抗原表位,很有可能是一个极具肿瘤血管靶向治疗前景的多肽.     

人结肠癌血管特异结合短肽的噬菌体肽库筛选及鉴定

目的：通过建立小鼠肾包膜下荷人结肠癌模型、利用噬菌体肽库体内筛选技术,筛选并鉴定能够与人结肠癌血管内皮细胞特异结合的噬菌体呈现短肽.方法：制备免疫抑制小鼠肾包膜下人结肠癌移植瘤动物模型.将随机环七肽库通过尾静脉注入荷瘤鼠体内,回收归巢于肿瘤组织的噬菌体,进行4轮体内筛选,随机挑取20个克隆进行测序.细胞ELISA实验初步鉴定阳性噬菌体的内皮细胞结合能力.免疫细胞化学染色鉴定阳性噬菌体克隆与共培养内皮细胞的结合能力.免疫荧光技术检测短肽与共培养内皮细胞的特异性结合能力.结果：18个克隆测序正确,它们呈现2种氨基酸序列,命名为CV1及CV2,其呈现噬菌体称为pCV1及pCV2,其中CV2/pCV2重复次数多.细胞ELISA结果显示pCV2与Co-HUVECs（与结肠癌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞）的结合明显高于HUVECs（人脐静脉内皮细胞）,有显著的差异性结合,而pCV1在Co-HUVECs,HUVECs上结合均较少,无差异性结合.免疫荧光染色结果显示,FITC-CV2特异性结合于Co-HUVECs的胞膜与核周胞质.结论：得到两个能特异性结合于结肠癌移植瘤的噬菌体单克隆pCV1及pCV2.pCV2具有特异结合结肠癌血管的能力,有可能用于结肠癌血管靶向治疗.     

噬菌体肽库筛选隐丹参酮高亲和性结合肽

通过噬菌体十二肽库,以隐丹参酮为靶分子,筛选与隐丹参酮具有高亲和性的结合短肽。经过噬菌体十二肽库的3轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,挑选结合力强的克隆进行测序,得到隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,并进行生物信息学分析。本试验共筛选到10个隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,有614种蛋白质与其结构相匹配。多肽序列的核心序列为VILDFGEI。本研究获得了与隐丹参酮结合的高亲和性多肽,为深入研究隐丹参酮的作用靶点以及分子作用机制提供了实验依据和结构基础。     

运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的：随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17（Sp17）特异性结合的短肽序列,并进行鉴定.方法：以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛.富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析.结果：随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRMII、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMRIMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRRIRKQ.结论：从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列.