共刺激分子异常介导寻常型银屑病免疫失衡的实验研究

目的通过检查外周血免疫细胞共刺激分子和细胞因子表达格局,分析寻常性银屑病患者可能发生的免疫异常。方法选择未经治疗的寻常型银屑病患者与正常对照组,抽取外周血并分离单个核细胞(peripheral bloodmonocytes,PBMC),采用RT-PCR对寻常型银屑病患者和正常对照组外周血CD86、B7H1、Foxp3、T-bet、GATA-3指标进行检测。采用流式细胞仪检查两组外周血清中IL-12、IFN-γ、IL-17、IL-2、IL-10、IL-9、IL-22、IL-6、IL-13、IL-4、IL-5、IL-1β、TNF-α含量。结果寻常型银屑病组PBMC中Foxp3和GATA3表达低于正常人群,但T-bet表达增高(P<0.05)。寻常型银屑病患者TNF-α明显高于正常对照组(P<0.05)。寻常型银屑病患者CD86相对表达量(0.3636±0.1003)明显高于对照组(0.1061±0.03883)(P<0.05);而B7H1相对表达量(0.06876±0.03145)明显低于对照组(0.3401±0.1152)(P<0.05)。结论寻常型银屑病患者Th1亚群增加、TNFa水平增高,而Th2和调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)亚群明显降低;寻常型银屑病患者外周血抗原递呈细胞(antigen present cells,APC)表达共刺激分子CD86增加而共抑制分子B7H1降低,提示寻常型银屑病患者体内存在的免疫功能紊乱可能是由于其APC功能异常所致。     

左归丸对小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞的影响

目的:观察左归丸制剂对小鼠脾细胞中Treg亚群及其相关细胞因子表达的影响。方法:BALB/c小鼠给予不同剂量左归丸处理后,利用流式细胞术检测小鼠脾细胞中Treg亚群(CD4+/CD25+)的变化;采用RT-PCR法检测小鼠脾细胞中IL-10、TGF-β、IFN-γ及Foxp3的表达水平;采用ELISA法检测小鼠外周血中IFN-γ的分泌水平。结果:小剂量左归丸对小鼠脾脏Treg亚群及相关细胞因子的表达没有显著影响;中剂量左归丸可明显上调小鼠脾脏Treg亚群比例(P<0.05),提高Treg特异性胞内信号Foxp3及相关细胞因子IL-10、TGF-β的转录水平,同时抑制IFN-γ的表达;大剂量左归丸可显著降低Treg细胞亚群比例,对Foxp3I、L-10、TGF-β、IFN-γ的表达均有明显的抑制作用(P<0.05)。随着中、大剂量左归丸处理小鼠IFN-γ的转录下调,血清中IFN-γ的水平也明显下降(P<0.05)。结论:左归丸可上调Treg细胞及相关细胞因子的表达水平,抑制IFN-γ的表达,但这种免疫效应有剂量限制性,大剂量应用时显示抑制作用,提示左归丸对Treg亚群有剂量依赖性的双向调节作用。     

CD4~+CD25~+T细胞在实验性重症肌无力中的作用研究

目的:探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型小鼠外周免疫耐受机制异常在疾病发生、发展中的作用。方法:检测成模组小鼠CD4+脾细胞中CD4+CD25+T细胞(Treg)水平,脾细胞Foxp3mRNA的表达情况,并与未成模组、弗氏佐剂组及正常对照组进行比较。结果:与未成模组、弗氏佐剂组及正常对照组相比,成模组小鼠CD4+脾细胞内Treg的水平明显下降(P<0.01),脾细胞Foxp3mRNA的表达降低(P<0.01)。结论:EAMG模型小鼠存在外周免疫耐受缺陷,FoxP3基因可能通过影响Treg的数量和功能在EAMG的发病中起作用。     

经水摄入三氯乙烯对小鼠调节性T细胞的影响

目的研究经水摄入三氯乙烯(TCE)对小鼠调节性T细胞(Treg)的影响。方法♀BALB/c小鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组以及2.5、5 g/L TCE组,TCE经饮水染毒,分别在2、4、8、12周处死动物,采集外周血并取脾脏。流式细胞仪检测脾脏Treg细胞数量,荧光定量RT-PCR检测Treg细胞特异转录因子Foxp3 mRNA表达水平,ELISA法检测血清中白介素10(IL-10)含量。结果 TCE 2.5、5.0 g/L组小鼠脾脏Treg细胞数量比空白和溶剂对照组明显降低,2、4、8周时差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);脾脏Foxp3 mRNA表达与对照组比较,TCE暴露组明显降低,2、4、8周时差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),4周时最低;血清中IL-10含量与对照组比较,TCE 2.5、5.0 g/L组明显降低,2、4周时差异均有统计学意义(P<0.05),4周时最低;相关分析显示脾脏中Treg细胞数量和血清中细胞因子IL-10含量呈正相关(r=0.768,P<0.01)。结论经水摄入TCE对小鼠Treg细胞有显著影响。     

寻常型天疱疮患者外周血调节性T淋巴细胞数量及Foxp3基因表达

目的研究寻常型天疱疮(PV)患者外周血调节性T淋巴细胞(Treg),即CD4 CD25 Foxp3 T细胞的数量及其Foxp3mRNA的表达水平,探讨其在PV发病机制中的作用。方法收集15例PV患者(PV组)和15名健康人(对照组)外周抗凝静脉血,分离外周血单个核细胞。分别用FITC标记抗CD4单抗,APC标记抗CD25单抗,PE标记抗Foxp3单抗,流式细胞仪检测分析PV患者外周血Treg在CD4 T细胞中的百分率及CD4 T细胞在淋巴细胞中的百分率;荧光定量PCR检测外周血单个核细胞Foxp3 mRNA表达情况。结果PV组外周血Treg在CD4 T细胞中百分率为(6.99±1.86)%,CD4 T细胞在淋巴细胞中的百分率为(32.78±8.33)%,对照组分别为(7.95±1.68)%和(33.45±7.32)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);荧光定量PCR检测结果显示,PV组与对照组Foxp3 mRNA相对表达量分别为8.80±5.53和8.47±5.46,两组比较无显著差异(P>0.05)。结论调节性T细胞可能不直接参与PV的发生。     

趋化因子受体CXCR3 mRNA在寻常型银屑病患者皮损及外周血单个核细胞中的表达

目的 研究手常型银屑病患者皮损及外周血单一核细胞(PBMC)中趋化因子受体CXCR3 mRNA的表达及其临床意义.方法 RT-PCR法测定20例银屑病患者皮损和10例健康正常人皮肤及其PBMC中CXCR3 mRNA的表达;直线相关性分析方法分析银屑病患者皮损及PBMC中CXCRB的表达水平与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)之间的关系.结果 银屑病患者皮损及PBMC中CXCR3 mKNA表达相对含量分剐为(1.44±0.72)和(1.49±0.10),正常人皮肤及PBMC中CXCR3 mRNA相对含量为(0.51±0.10)和(0.45±0.09).经统计学分析,银屑病皮损及外周血PBMC中CXCR3的mRNA表达明显高于正常对照组,差异有显著性(P<0.05);银屑病患者CXCR.3 mRNA的表达水平与PASI呈正相关(P<0.05).结论 趋化性因子受体CXCR3可能参与了在银屑病的发病过程.     

清肝凉血解毒方和凉血活血方对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠行为学及神经肽Y表达影响

目的:观察清肝凉血解毒方(QGLXJD)、凉血活血方(LXHX)对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠行为学及神经肽Y(NPY)表达的影响。方法:30只BALB/c雄性小鼠,剔除背部毛发,随机分为空白对照组(C)、模型组(M)、清肝凉血解毒方组(QG)、凉血活血方组(LX)和甲氨蝶呤组(MTX)。背部涂抹5%咪喹莫特乳膏(IMQ)诱导皮肤银屑病样模型。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis area and severity index,PASI)每日进行评分,分别运用旷场及高架十字迷宫评价各组小鼠行为学差异,HE染色后光镜下测量表皮厚度;免疫组化法检测皮损中T淋巴细胞表面标志CD3+及表皮中增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况;采用实时PCR技术检测皮损中IL-23、IL-1β、IL-12 mRNA表达水平;Western blot法检测皮损中NPY蛋白表达情况。结果:与C组相比,M组表皮厚度、PCNA、CD3+T细胞、IL-1β、IL-12、IL-23 mRNA表达均增加(P0.05);其余组与M组相比,表皮薄,PCNA、CD3+T细胞、IL-1β、IL-12、IL-23 mRNA表达水平均降低(P0.05)。与C组比较,银屑病样小鼠焦虑水平高,以M组最为明显;QG组与M组比较,焦虑水平低,而LX组与QG组比较,焦虑水平高;NPY在M组中表达最多,在LX、QG、C组表达依次减少。结论:清肝凉血解毒方能改善银屑病样小鼠的焦虑行为,下调NPY的表达水平,从整体角度改善小鼠银屑病样皮损。     

双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究

目的验证双氢青蒿素(DHA)是否能改善咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠皮损, 并探讨其可能的机制。方法24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、25 mg/kg DHA治疗组(DHA-L组)、50 mg/kg DHA治疗组(DHA-H组)，每组6只。每天观测小鼠皮肤变化并进行PASI评分。连续给药6 d，取小鼠皮肤进行HE染色和Ki67免疫组织化学染色；流式细胞仪检测小鼠脾Th17细胞和调节性T细胞(Treg)；ELISA检测小鼠血清白细胞介素17A(IL-17A)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果IMQ成功诱导银屑病小鼠模型，DHA治疗后小鼠皮损改善，组织病理学改善，DHA-L和DHA-H组PASI评分及Ki67阳性细胞数量均低于Model组(P < 0.05)；Model组脾Th17细胞比例较Control组升高(P < 0.05)，DHA-L组和DHA-H组均较Model组降低(P < 0.05)；DHA-L组和DHA-H组脾Treg细胞比例较Model组升高(P < 0.05)；Model组血清IL-17A和TNF-α水平均较Control组升高(P < 0.05)，与Model组相比，血清IL-17A水平在DHA-L和DHA-H组均降低(P < 0.05)，而血清TNF-α水平仅DHA-H组降低(P < 0.05)。结论DHA可以改善IMQ诱导的银屑病小鼠皮损，其机制可能和调节Th17/Treg细胞平衡有关。     

寻常型天疱疮患者外周血调节性T淋巴细胞数量及Foxp3基因表达

目的 研究寻常型天疱疮(PV)患者外周血调节性T淋巴细胞(Treg),即CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞的数量及其Foxp3mRNA的表达水平,探讨其在PV发病机制中的作用.方法 收集15例PV患者(PV组)和15名健康人(对照组)外周抗凝静脉血,分离外周血单个核细胞.分别用FITC标记抗CIM单抗,APC标记抗CD25单抗,PE标记抗Foxp3单抗,流式细胞仪检测分析PV患者外周血Treg在CD4+ T细胞中的百分率及CD4+ T细胞在淋巴细胞中的百分率;荧光定量PCR检测外周血单个核细胞Foxp3 mRNA表达情况.结果 PV组外周血Treg在CD4+ T细胞中百分率为(6.99±1.86)%,CD4+ T细胞在淋巴细胞中的百分率为(32.78±8.33)%,对照组分别为(7.95±1.68)%和(33.45±7.32)%,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);荧光定量PCR检测结果显示,PV组与对照组Foxp3 mRNA相对表达量分别为8.80±5.53和8.47±5.46,两组比较无显著差异(P＞0.05).结论 调节性T细胞可能不直接参与PV的发生.     

白细胞介素10在银屑病中的表达特征及影响

目的：分析银屑病患者及银屑病小鼠模型皮损处白细胞介素10(IL-10)特点及其与银屑病严重程度的相关性,探讨IL-10的表达对银屑病的影响。方法：收集2018年10月至2019年12月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院收治的40例银屑病患者病损皮肤,同时通过咪喹莫特(IMQ)分别诱导C57BL/6(WT)小鼠和IL-10敲除(IL-10^-/-)小鼠致银屑病模型。采用PASI评分观察皮损动态变化;HE染色观察皮损组织形态学变化、表皮厚度及炎症细胞浸润程度;免疫组化检测皮损组织中IL-10和CD19蛋白表达;免疫荧光染色分析皮损组织中CD4定位改变情况。结果：IMQ造模可以取得与临床银屑病患者相类似的皮肤表现。IL-10^-/-造模组小鼠背部皮损处红斑评分、鳞屑评分、皮肤浸润厚度评分及PASI总评分和耳朵厚度较WT造模组和IL-10^-/-对照组均明显升高(P<0.05)。免疫组化结果显示WT造模组小鼠皮损组织中IL-10的表达阳性率低于WT对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-10^-/-     

解毒药与凉血药配伍对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的干预作用

目的 观察凉血解毒汤与凉血汤对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损的影响,并探讨配伍解毒药在银屑病中的作用机制。方法 BALB/c小鼠55只,背部剃毛,采用数字表法随机分为空白对照组、模型组、凉血汤组、凉血解毒汤组和甲氨蝶呤组,采用5%（质量分数）咪喹莫特乳膏背部涂抹诱导皮肤银屑病样模型。观察皮损面积和疾病严重程度（psoriasis area and severity index,PASI）并评分,光镜下观察皮损组织形态学变化及表皮层厚度;采用皮肤水分油分测试笔检测小鼠背部皮肤水分和油分含量;采用免疫组织化学染色法观察小鼠皮损中增生细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和T淋巴细胞表面标志CD3表达;采用RT-PCR技术检测皮损中白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）、IL-23及IL-1β mRNA表达。结果 与模型组相比,凉血解毒汤和凉血汤组小鼠皮损PASI评分及表皮厚度均明显降低、PCNA阳性细胞百分比下降、CD3阳性T细胞表达个数减少、IL-1β mRNA相对表达量相对下降（P<0.05）;此外凉血解毒汤还可使小鼠皮损中水分（16.980±2.739）、油分（7.750±1.209）含量有效升高（P<0.05）,IL-17、IL-23 mRNA相对表达量明显下降（P<0.05）,对皮损PASI评分及表皮厚度、PCNA阳性细胞百分比（5.66±0.057）和CD3阳性T细胞表达个数（10.670±0.193）的影响也更为显著（P<0.01）。结论 凉血解毒汤与凉血汤均可抑制IL-1β mRNA的表达,减少炎性浸润,改善咪喹莫特诱导的银屑病样炎性反应皮损;而配伍解毒药的凉血解毒汤,则可进一步通过抑制IL-23、IL-17的表达,提升其在改善皮肤屏障功能及皮损组织形态变化、减缓表皮角质形成细胞增生、减少角化不全细胞及降低炎性反应浸润程度等方面的干预作用,从而缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损改变,提示解毒中药对炎性反应及相关因子的抑制作用可能是其治疗银屑病的潜在机制之一。     

CXCR3在银屑病患者的表达及其临床意义

目的研究银屑病患者皮损内趋化性细胞因子受体CXCR3的表达及其临床意义。方法利用荧光定量聚合酶链反应法测定20例寻常型银屑病患者皮损内及17例正常对照者皮肤中CXCR3 mRNA的定量表达,采用直线相关回归分析方法分析CXCR3 mRNA的表达与银屑病病情严重程度(PASI)的关系。结果银屑病皮损内CXCR3 mRNA高于正常对照者皮肤内的表达水平(P<0.01)。银屑病皮损内CXCR3 mRNA的表达与患者病情严重程度呈显著的正相关(r=0.72465,P<0.01)。结论趋化性细胞因子受体CXCR3可能在银屑病的发病中起重要作用。     

信号转导和转录激活因子4及γ-干扰素在银屑病患者皮损中的表达及其意义

目的研究银屑病患者皮损内信号转导和转录激活因子4(STAT4)及γ-干扰素(IFN-γ)的表达及其临床意义。方法利用荧光定量聚合酶链反应法测定20例寻常型银屑病患者皮损内及17例正常对照者皮肤中STAT4 mRNA及IFN-γmRNA的定量表达,采用直线相关回归分析方法分析STAT4mRNA及IFN-γmRNA的表达与银屑病病情严重指数(PASI)的相关性,STAT4mRNA与IFN-γmRNA表达的相关性。结果银屑病皮损内STAT4mRNA及IFN-γmRNA的表达均高于正常对照者皮肤内的表达水平(P<0.001)。银屑病皮损内STAT4mRNA的表达与患者PASI呈显著的正相关(r=0.78465,P<0.0001),IFN-γmRNA的表达与患者PASI无显著相关性(r=-0.16125,P=0.4970)。银屑病皮损内STAT4mRNA的表达与IFN-γmRNA的表达呈显著的正相关(r=0.62149,P=0.0034)。结论STAT4可能通过上调IFN-γ的表达,促进银屑病的炎症进程。     

低剂量环磷酰胺对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+Treg细胞功能的影响

目的：研究低剂量环磷酰胺（CTX）单次注射对Lewis肺癌小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞功能的影响,探讨CD4⁺CD25⁺Treg 细胞与肿瘤发生、发展的关系。方法：将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠右腋皮下,建立Lewis肺癌模型,随机分成3组：CTX组、肿瘤组、单纯对照组。采用CTX单次注射,观测各组肿瘤体积动态变化;采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量变化;采用半定量RT-PCR方法检测各组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平;采用MTT法检测脾脏T淋巴细胞增殖功能;采用LDH释放法检测脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)细胞的杀伤活性。结果：与未治疗肿瘤组相比,CTX治疗可延缓荷19 d Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长;CTX组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平明显低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞功能明显高于肿瘤组（P<0. 05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞杀伤活性比肿瘤组略高,但变化不显著（P>0.05）。结论：CTX单次注射可降低Lewis肺癌小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞的数量及Foxp3 mRNA表达,使T淋巴细胞增殖功能及脾细胞中CTLs杀伤功能增强。     

成人微小病变肾病患者外周血CD4~＋Foxp3~＋调节性T细胞的研究

目的研究CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（CD4＋Foxp3＋Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4＋T细胞中的分布,探讨CD4＋Foxp3＋Treg参与MCD发病的可能机制。方法以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4＋Foxp3＋Treg及亚群占CD4＋T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达。设立正常对照。结果流式细胞检测显示CD4＋Foxp3＋Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA＋Foxp3low（Ⅰ区,静息期Treg）、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg）和CD45RA-Foxp3low（Ⅲ区）。MCD组Ⅰ区＋Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比显著低于对照组（P〈0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3mRNA表达较对照组下调（P〈0.05）,RORcmRNA表达较对照组上调（P〈0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达均显著高于对照组（P〈0.05和P〈0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比呈显著负相关（r=-0.81,P〈0.05）。结论成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

西格列汀对2型糖尿病合并颈动脉硬化患者氧化应激指标和内皮素的影响

目的: 检测芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)在原因不明自然流产患者蜕膜组织中的表达,探讨其表达与蜕膜中调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)/Th17细胞因子平衡之间的关系。方法: 选择原因不明复发性流产患者23 例作为观察组,另选择正常早孕妇女30例作为对照组;采用实时荧光定量PCR法检测两组蜕膜组织中AhR、叉头样转录因子p3 (forkhead box p3,Foxp3)、IL-10及维甲酸孤独核受体γ(retinoic acid receptor-related orphan receptors γ,ROR-γ)等 mRNA表达,并对AhR mRNA表达与Foxp3、IL-10、ROR-γ mRNA表达作相关分析。结果：观察组蜕膜中AhR mRNA、ROR-γ mRNA表达明显高于对照组,但Foxp3 mRNA、IL-10 mRNA则明显低于对照组(P均<0.05)。两组蜕膜中AhR mRNA表达与ROR-γ mRNA 表达呈正相关(P均<0.05),与Foxp3 mRNA以及IL 10 mRNA表达则无明显相关性(P均＞0.05)。结论：原因不明自然流产患者蜕膜中AhR mRNA及Th17细胞因子表达均升高,而Treg细胞因子表达下降,Treg/Th17细胞比例下降。AhR表达增高与Th17细胞因子上调相关。