bromodomain结构域对溴区包含蛋白7亚细胞定位的影响

目的：探讨溴区包含蛋白7(BRD7)的亚细胞定位以及bromodomain结构域对BRD7亚细胞定位的影响。方法：首先采用GFP介导的亚细胞定位方法,在非洲绿猴肾COS7细胞中考察BRD7的亚细胞定位;然后分别构建bromodomain缺失型的BRD7重组体pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7...     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

Wilson病ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体构建及功能研究

【目的】构建ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体，研究其在Tx小鼠肝细胞中的表达及功能。【方法】利用长片断PCR和质粒重组技术构建不同铜离子结合区的缺失体，脂质体介导转染Tx小鼠肝脏细胞，然后进行高铜、低铜孵育，观察ATP7B突变蛋白在细胞内的定向移动及对铜离子转运功能的影响。【结果】ATP7B基因1．4铜离子结合区逐个缺失后，ATP7B蛋白定向移动减慢至消失；5．6铜离子结合区缺失，细胞铜转运功能停滞。【结论】ATP7B基因6个铜离子结合区功能不同，其中1．4结合区主要根据铜浓度诱导ATP7B蛋白细胞内定向移动，而5．6结合区则直接参与铜离子细胞外转运。     

Wilson病ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体构建及功能研究

【目的】构建ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体,研究其在Tx小鼠肝细胞中的表达及功能。【方法】利用长片断PCR和质粒重组技术构建不同铜离子结合区的缺失体,脂质体介导转染Tx小鼠肝脏细胞,然后进行高铜、低铜孵育,观察ATP7B突变蛋白在细胞内的定向移动及对铜离子转运功能的影响。【结果】ATP7B基因1-4铜离子结合区逐个缺失后,ATP7B蛋白定向移动减慢至消失;5-6铜离子结合区缺失,细胞铜转运功能停滞。【结论】ATP7B基因6个铜离子结合区功能不同,其中1-4结合区主要根据铜浓度诱导ATP7B蛋白细胞内定向移动,而5-6结合区则直接参与铜离子细胞外转运。     

应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA

目的:利用体外DNA 同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体.方法:在引物5′加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA 聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重...     

基于荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测美洲钩虫方法研究

目的 建立基于荧光重组酶聚合酶核酸扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术快速检测粪样中美洲钩虫卵的方法,并评价其效能,为快速检测粪样中美洲钩虫卵提供技术支撑。方法 根据美洲钩虫的cox1基因序列设计荧光RPA引物及探针并进行筛选,建立荧光RPA检测方法。将美洲钩虫卵基因组DNA稀释至100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL等7个浓度梯度以测定荧光RPA法的最低检出值,利用荧光RPA法检测日本血吸虫、蛔虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫DNA样本进行交叉反应实验。采集44例人粪样并进行DNA提取,运用改良加藤厚涂片法（Kato-Katz）、半巢式PCR法、荧光RPA法同时检测,评价荧光RPA法的灵敏度和特异度。结果 建立的荧光RPA法可在20 min内特异性扩增出美洲钩虫cox1基因长度为194 bp的片段,最低检出值为10 fg/μL,与日本血吸虫、蛔虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫均无交叉反应。通过对44份人粪便样本进行检测,Kato-Katz法和半巢式PC...     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

【目的】构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。【结论】乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

用同源重组法构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库的探索

目的探索卵巢成熟及明确早胚发育过程中,构建小鼠卵母细胞cDNA文库筛选所涉及的相互作用蛋白。方法利用SMART技术,构建酵母双杂交筛选卵母细胞中与输卵管蛋白相互作用的靶分子成分为目的,构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。采用Stratagene RNA prepkit抽提500枚卵母细胞总RNA,应用线性化载体pGADT7-Rec在体构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。结果文库的滴度为3.7×106,重组片段大小主要集中在0.6-0.9kb,重组率为60%。结论所构建的小鼠卵母细胞cDNA文库可用于酵母双杂交筛选。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义荧光真核表达载体,并检测其在人胚胎成纤维细胞中的表达．方法：采用基因重组技术,将hTERT cDNA正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中,NotI酶切鉴定;采用脂质法,将重组基因pIRES2-EGFP-hTERT转染入原代培养的人胚胎成纤维细胞;采用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及Western blot检测hTERT在胚胎成纤维细胞中的表达．结果：经NotI酶切后,hTERT正义重组质粒被切成1．4kb和7．4kb2个片段,反义重组质粒为4．8kb和4．0kb2个片段,与理论预期长度相符;pIRER2-EGFP-hTERT重组基因经脂质法转染,G418筛选,获得一个阳性克隆,激光共聚焦显微镜下可见明显的绿色荧光,RT-PCR及Western blot可见hTERT mRNA转录及其蛋白的表达。结论：成功构建了h TERT正义荧光真核表达载体,并可在人胚胎成纤维细胞中表达。     

革兰阴性菌基因快速失活载体的构建及其应用

目的 构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用.方法 应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统.载体成分主要包括:π蛋白依赖件复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个Xcm Ⅰ酶切位点的T载体形成片段以及多种耐药片段,包括Chl(氯霉素抗性)、Tet(四环素抗性)、Km(卡那霉素抗性),获得的载体分别命名为EK3-Chl、EK3-Tet、EK3-Km.采用构建的EK3-Tet载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行插入突变,以验证其有效性.通过Xcm Ⅰ酶切EK3-Tet质粒形成T载体状态,将PCR扩增得到的两端截短的yeeZ基因与该T载体直接连接,获得的质粒采用接合方式转移到弗氏枸橼酸杆菌ATCCS090中以实现整合,双抗培养基筛选整合突变株,对获得的突变株进行鉴定和形态观察.结果 成功构建了EK3-Chl、EK3-Tet和EK3-Km,并对yeeZ基因进行插入突变获得突变株,步骤简便,工作周期短.结论 上述构建的载体系统能够对革兰阴性菌进行目的 基因的快速插入失活,该载体可在细菌基因功能研究中得到一定的应用.     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2的构建

目的：构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法：应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7—2 cDNA基闪片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM—T和pEGFP—C3上．结果与结论：酶切及测序证实成功构建了克隆载休pGEM—B7—2和真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—B7—2。