RNA干扰抑制HMGB1基因表达对子宫内膜癌的增殖抑制作用及其分子机制

目的：研究RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的表达对子宫内膜癌 细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期、细胞凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：构建靶向HMGB1 基因的慢病毒shRNA载体,转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,同时利用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染 HMGB1-siRNA后细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法和流式细胞术分别检测转染HMGB1-siRNA后 HEC-1A细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。Western印迹检测转染HMGB1-siRNA后细胞AKT,pAKT和cyclinD1 的蛋白表达水平。结果：慢病毒HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)在HEC-1A细胞 中的表达;转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.01),并能阻滞细胞于G0/G1期,且明显 诱导细胞凋亡;转染HMGB1 shRNA组、空白对照组和阴性对照组的总凋亡率分别为(17.89±0.23)%,(4.69±0.20)%和 (4.62±0.17)%,3组之间差异有统计表达学意义(P<0.01)。转染HMGB1 shRNA后细胞pAKT和cyclinD1蛋白表达水平均下 调(均P<0.01)。结论：HMGB1表达下调可以有效地抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且可诱 导细胞凋亡,影响磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路及下调cyclinD1的蛋白表达水平可能为其主要作 用机制。     

小干扰RNA抑制HMGB1表达对子宫内膜癌细胞侵袭与迁移的影响

目的：探讨靶向HMGB1的shRNA对HMGB1表达改变的影响及其与子宫内膜癌细胞侵袭与迁移力改变的关系。方法：运用RNA干扰技术，构建HMGB1短发夹RNA(pshRNA-1 /HMGB1，pshRNA-2 /HMGB1，pshRNA-3/HMGB1)，同时设置转染非特异性质粒的阴性对照组 (HMGB1/p-NC) 和脂质体转染组 (Lipo组) ，用脂质体法转染人子宫内膜癌细胞(HEC-1A)，利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测转染后48 h各组细胞HMGB1在 mRNA和蛋白水平的表达，Transwell小室法观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的侵袭情况，细胞划痕实验观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的迁移情况。结果：RT-PCR显示：3组重组质粒HMGB1-pshRNAs转染后，HMGB1 mRNA相对表达水平分别是0.192±0.006，0.055±0.002和0.123±0.086，较Lipo组(0.268±0.008)和HMGB1/p-NC组(0.270±0.004)明显减少(P<0.05)，最大抑制率分别达28.4%，79.5%和54.1%。Western印迹显示：HMGB1蛋白相对表达水平分别是0.259±0.129，0.032±0.002和0.104±0.007，较Lipo组(0.347±0.007)和HMGB1/p-NC组(0.349±0.007)明显减少(P<0.05)，最大抑制率分别达25.4%，90.8%和70.0%。实验组在接种后48 h，穿过Transwell小室膜的细胞数显著少于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。划痕愈合实验亦显示实验组划痕愈合率明显低于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。结论：靶向干扰HMGB1的shRNA可以抑制HMGB1的表达，转染后的子宫内膜癌细胞侵袭与迁移能力明显
下降。     

小干扰RNA抑制HMGB1表达对子宫内膜癌细胞侵袭与迁移的影响

目的:探讨靶向HMGB1的shRNA对HMGB1表达改变的影响及其与子宫内膜癌细胞侵袭与迁移力改变的关系.方法:运用RNA干扰技术,构建HMGB1短发夹RNA(pshRNA-1 /HMGB1,pshRNA-2/HMGB1,pshRNA-3/HMGB1),同时设置转染非特异性质粒的阴性对照组(HMGB1/p-NC)和脂质体转染组(Lipo组),用脂质体法转染人子宫内膜癌细胞(HEC-1A),利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测转染后48 h各组细胞HMGB1在mRNA和蛋白水平的表达,Transwell小室法观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的侵袭情况,细胞划痕实验观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的迁移情况.结果:RT-PCR显示:3组重组质粒HMGB 1-pshRNAs转染后,HMGB1 mRNA相对表达水平分别是0.192±0.006,0.055±0.002和0.123±0.086,较Lipo组(0.268±0.008)和HMGB1/p-NC组(0.270±0.004)明显减少(P＜0.05),最大抑制率分别达28.4％,79.5％和54.1％.Western印迹显示:HMGB1蛋白相对表达水平分别是0.259±0.129.0.032±0.002和0.104±0.007,较Lipo组(0.347±0.007)和HMGB1/p-NC组(0.349±0.007)明显减少(P＜0.05),最大抑制率分别达25.4％,90.8％和70.0％.实验组在接种后48 h,穿过Transwell小室膜的细胞数显著少于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P＜0.05).划痕愈合实验亦显示实验组划痕愈合率明显低于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P＜0.05).结论:靶向干扰HMGB1的shRNA可以抑制HMGB1的表达,转染后的子宫内膜癌细胞侵袭与迁移能力明显下降.     

氧化苦参碱对子宫内膜癌细胞侵袭转移的抑制作用及其机制探讨

目的:探讨氧化苦参碱对人子宫内膜癌细胞HEC-1-B增殖、侵袭转移的作用及其机制。方法:MTT法检测细胞增殖抑制率;Transwell小室法观察细胞侵袭转移的改变;Western blot及Real-time PCR法检测p38、p-p38、MMP-2和MMP-9表达水平的变化。结果:一定浓度氧化苦参碱可显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1-B的增殖、侵袭转移,并呈时间和剂量依赖性。氧化苦参碱可显著降低HEC-1-B细胞中p38及MMPs的表达水平。联合应用SB203580能够有效增强氧化苦参碱的抗肿瘤细胞侵袭转移能力。结论:氧化苦参碱可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭转移,并下调p38磷酸化以及MMP2、MMP9的表达。     

PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

曲古霉素A对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及相关机制

【目的】探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及其可能机制。【方法】应用不同浓度的TSA处理子宫内膜癌HEC-1B细胞72 h,Western blotting法检测细胞内组蛋白H4乙酰化水平及p21蛋白,荧光定量PCR方法检测p21基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】经TSA作用后,人子宫内膜癌HEC-1B细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加,p21基因mRNA及蛋白表达增加;同时细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。【结论】TSA通过提高组蛋白乙酰化水平,增加p21基因表达,抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖和诱导细胞凋亡。     

miR-193b对子宫内膜癌侵袭的影响

目的 探讨miR-193b对人子宫内膜癌细胞侵袭的影响及其机制.方法 人子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞转染miR-193b抑制剂(miR-193b inhibitor) 24h后,利用Transwell小室评价分析其侵袭能力的变化.进一步,我们利用Western blot验证侵袭相关基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)-2、MMP-9蛋白的表达.结果 miR-193b inhibitor有效抑制HEC-1A细胞细胞内miR-193b表达,并且其侵袭能力较对照组明显下降(P＜0.05).Western blot验证miR-193b inhibitor可有效抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达.结论 miR-193b通过可调节侵袭相关MMP-2、MMP-9蛋白表达有效调控HEC-1A细胞细胞侵袭能力.     

靶向干扰Livin对HEC-1-A细胞侵袭迁移能力的影响

目的 探讨靶向抑制Livin对人子宫内膜癌细胞株(HEC-1-A)细胞侵袭及迁移能力的影响.方法 将Livin的特异性小分子干扰RNA(Livin-siRNA)和阴性对照序列(Livin-NC)应用脂质体法转染HEC-1-A细胞,试验分为Livin-si组、Livin-NC组和Livin-B组.应用qRT-PCR及Western blot法检测转染Livin-siRNA后,Livin mRNA及蛋白表达情况.Transwell小室试验观察干扰Livin后,HEC-1-A细胞侵袭及迁移能力的变化.结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Livin-si组Livin mRNA及蛋白相对表达量明显减少(P＜0.01).侵袭及迁移试验结果显示,抑制Livin表达后,Livin-si组穿膜细胞数明显减少(P＜0.01).结论 Livin-siRNA能有效抑制Livin在HEC-1-A细胞中的表达,靶向干扰Livin可明显减弱HEC-1-A细胞的侵袭及迁移能力.     

长链非编码 RNA GAS5 在子宫内膜癌中的表达及对肿瘤侵袭的影响

探讨长链非编码 RNA GAS5 在子宫内膜癌组织中的表达及其对子宫内膜癌 HEC-1A 细胞侵袭能力的影响。方法 筛选 2013 年 1 月 -2015 年 12 月间于解放军 451 医院妇产科行手术切除的子宫内膜癌患者的癌及癌旁组织 50 例,分析 lncRNA-GAS5 在组织中的表达水平及临床意义;通过重组质粒在人子宫内膜癌 HEC-1A 细胞中过表达 lncRNA-GAS5,采用 Transwell 侵袭小室模型检测过表达 lncRNA-GAS5 后HEC-1A 细胞侵袭能力变化,qRT-PCR 检测 microRNA-21 的表达变化,qRT-PCR 及 Western blot 检测PTEN 表达变化。结果 lncRNA-GAS5 在子宫内膜癌组织中表达水平低于对应癌旁组织（ =4.013, <0.05）,子宫内膜癌组织中长链非编码核醣核酸生长组织特异性转录体 5（lncRNA-GAS5）低表达与肿瘤淋巴结转移（ =2.389, =0.017）及高 FIGO 分期（III+IV 期,=2.131, =0.021）差异有统计学意义;lncRNA-GAS5 重组质粒转染 HEC-1A 细胞后可抑制细胞的侵袭能力（ =7.654, =0.008）;qRT-PCR 检测发现过表达 lncR-NA-GAS5 后 microRNA-21（miR-21）的表达水平升高（ =23.533, <0.05）,qRT-PCR 及 Western blot 结果证实,过表达 lncRNA-GAS5 后可促进 的表达（ <0.05）。结论 lncRNA-GAS5 在子宫内膜癌组织中表达降低,lncRNA-GAS5 可能通过下调 miR-21 的表达进而恢复 PTEN 的表达来抑制子宫内膜癌转移。     

逆转录病毒介导shRNA抑制Mig-7基因对人肝癌细胞血管生成拟态及体外侵袭转移的抑制作用

目的探讨逆转录病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰迁移诱导基因7（Mig-7）对肝细胞癌（HCC）细胞血管生成拟态 （VM）形成及体外侵袭转移能力的影响。方法设计2条Mig-7 mRNA寡核苷酸序列（Mig-7 shRNA-1,Mig-7 shRNA-2）和1条 作为负对照的无关序列（Mig-7 shRNA-N）。构建Mig-7shRNA 逆转录病毒表达载体质粒,并将要接受转染的人肝癌细胞 MHCC-97H分为6组：转染Mig-7 shRNA-1组;转染Mig-7 shRNA-2组;转染Mig-7 shRNA-N组;转染空载质粒组（Vector）;重 组人血管内皮抑素（ES,商品名：恩度）组;MHCC-97H细胞对照组（Control）。半定量PCR、Western blot检测其对Mig-7表达的 影响;三维细胞培养观察其对VM形成的影响;细胞间粘附实验、Transwell侵袭实验及迁移实验观察其对细胞粘附、侵袭及迁移 能力的影响。结果转染后,Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组中Mig-7 mRNA与蛋白的表达、MHCC-97H细胞形成VM 能力、细胞侵袭、迁移能力明显减低（P<0.05）,细胞间粘附能力明显增加（P<0.05）;Mig-7 shRNA-N 组、Vector 组、ES 组中 MHCC-97H细胞Mig-7的表达、VM形成、细胞间粘附、迁移、侵袭能力较MHCC-97H细胞组均无明显变化。结论逆转录病毒 介导的shRNA能够有效下调Mig-7的表达并明显抑制HCC细胞VM形成能力及侵袭转移能力,增加细胞间的粘附作用;ES对 HCC细胞的Mig-7表达、VM形成、侵袭转移及粘附能力无明显影响。     

IGFBP-4对A549细胞免疫原性细胞死亡的作用及其机制

目的：探讨IGFBP-4对A549细胞免疫原性细胞死亡（ICD）的作用及其分子机制。方法：体外培养A549细胞,将细胞分为对照组、IGFBP-4组、IGFBP-4+NAC组和IGFBP4+si-p38组。经培养48 h后,用MTT法检测细胞存活率,流式细胞技术检测细胞内ROS、钙网蛋白（CRT）含量,ELISA法检测培养基中高迁移率族蛋白1（HMGB1）含量和细胞内SOD、MDA含量,Western blot法检测p-p38和p38表达。结果：与对照组相比,IGFBP-4组细胞内ROS、CRT、HMGB1、MDA含量、p-p38和p38表达升高,细胞存活率、SOD2含量下降（P＜0.05）;与IGFBP-4组相比,IGFBP-4+NAC组和IGFBP-4+si-p38细胞内ROS、CRT、HMGB1和MDA含量下降,细胞存活率、SOD2含量增高（P＜0.05）。结论：IGFBP-4通过激活p38 MAPK通路,诱发细胞内氧化应激促使A549细胞发生免疫原性细胞死亡。     

沉默乙酰肝素酶基因对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭能力的影响

目的观察沉默乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖及侵袭能力的影响。方法构建针对HPA基因的shRNA慢病毒载体,感染人卵巢癌SKOV3细胞。实验设计分为未转染组、实验转染组(选择3个靶点设计HPA-shRNA-1、HPA-shRNA-2、HPA-shRNA-3序列)、空白转染组;转染后,采用荧光定量PCR、Western blot方法检测HPA在基因水平和转录后蛋白水平的沉默效率;使用流式细胞仪检测细胞周期变化,CCK-8法检测细胞增殖情况,基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。结果①构建的shRNA慢病毒载体感染卵巢癌SKOV3细胞后,见HPA-shR-NA-1和HPA-shRNA-2序列的HPA基因和蛋白水平均显著下降(P<0.05),而HPA-shRNA-3序列在其表达上无降低,为无效转染序列;②实验转染组中有效转染序列HPA-shRNA-1、HPA-shRNA-2组中均见细胞G1期比例增加[分别为(69.69±3.87)%、(66.29±4.06)%],细胞增殖受到抑制[分别为(1.77±0.13)、(1.74±0.27)],穿膜细胞数显著减少[分别为(22.40±5.02)、(23.42±5.72)],与未转染组及空白转染组之间相比有明显差异(P<0.05)。结论干扰HPA基因后,对卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力有明显的抑制作用,其作用机制与HPA的基因和蛋白表达下调有关。     

TNF-α 通过 p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路对小胶质细胞HMGB1 表达的调控作用

目的：观察P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)抑制剂SB203580对 TNF-α诱导的原代培养大鼠小胶质细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达的影响。方法： 采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立对照组、TNF-α组(25 ng/mL)、TNF-α(25 ng/mL)+SB 203580组(10 μmol/L)、SB 203580组(10 μmol/L),各组细胞经药物处理16 h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1的表达情况,Western 印迹检测细胞HMGB1和磷酸化p38MAPK表达情况,用反转录PCR检测HMGB1 mRNA表达。结果：经TNF-α刺激 后,大鼠小胶质细胞及其培养上清液中HMGB1蛋白表达增高;SB 203580可抑制TNF-α诱导的磷酸化p38 MAPK表达 (P<0.01),同时下调HMGB1mRNA和HMGB1蛋白的表达。结论：TNF-α可诱导小胶质细胞晚期炎症因子HMGB1的表 达,并且其诱导机制与p38 MAPK被快速激活相关。     

Hsa-miR-193b抑制人子宫内膜腺癌细胞株HEC-1B侵袭能力

目的探讨Hsa-miR-193b对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B侵袭的影响及其相关机制。方法将Hsa-miR-193b模拟物(mimics)、Hsa-miR-193b抑制剂(inhibitor)转染HEC-1B细胞,Real-time PCR证实转染是否成功;Transwell小室法检测转染Hsa-miR-193b mimics后HEC-1B细胞的侵袭能力;通过miRGen、Targetscan、Pictar数据库筛查Hsa-miR-193b指向与侵袭相关的靶基因;Real-time PCR检测转染Hsa-miR-193b mimics转染组和对照组mRNA水平;Western blot检测各组GRB7蛋白表达的水平。结果①Hsa-miR-193b mimics、Hsa-miR-193b inhibitor转染HEC-1B细胞成功,两转染组Hsa-miR-193b表达水平与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②转染Hsa-miR-193b mimics组与对照组比较,肿瘤细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05)。③转染后,靶基因GRB7蛋白Hsa-miR-193b mimics组表达下降(P<0.05)、Hsa-miR-193b inhibitor组表达增加(P<0.05),且各组GRB7 mRNA水平无显著变化。结论在HEC-1B中转染Hsa-miR-193b mimics能下调GRB7蛋白表达,并抑制HEC-1B细胞的侵袭。     

STAT6基因沉默对结肠癌细胞增殖的影响

目的:研究细胞信号传导子和转录激活子6(STAT6)信号传导通路与结肠癌细胞增殖的关系及其可能机制。方法:构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体,转染人结肠癌细胞HT-29,以阻断STAT6信号通路;用RT-PCR方法检测STAT6 mRNA表达和流式细胞术检测磷酸化STAT6蛋白(pSTAT6)表达来验证构建效果;流式细胞术分析细胞周期变化;MTT法检测肿瘤细胞增殖状况;RT-PCR和Western blot观察p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因的表达起作用。     

shRNA干扰沉默RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:研究RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖?迁移及侵袭的影响?方法:应用脂质体技术将RNPC1a 短发夹RNA(shRNA)转染至SUM1315细胞,通过嘌呤霉素筛选出稳定细胞株,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测其干涉效率,并用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,划痕实验及Transwell细胞侵袭实验检测其迁移和侵袭能力?结果:经qRT-PCR和Western blot方法证实稳定转染RNPC1a shRNA的SUM1315细胞中RNPC1a的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P < 0.05),同时RNPC1a干扰后细胞的增殖?迁移及侵袭能力均减弱(P < 0.05)?结论:RNPC1a shRNA能有效地降低SUM1315细胞中RNPC1a基因的表达,RNPC1a基因沉默可以抑制SUM1315细胞的增殖?迁移及侵袭?