含药血清对成骨细胞矿化结节及Ⅰ型胶原形成的影响

为了解骨康对成骨细胞及骨形成的影响,采用从新生大鼠颅骨中分离出的成骨细胞,用酶法建立成骨细胞体外培养体系,观到中药含药血清对成骨细胞矿化结节和Ⅰ型胶原的影响。结果发现成骨细胞培养加合药血清后,成骨细胞内Ⅰ型胶原表达升高。说明含药血清可促进成骨细胞合成Ⅰ型胶原,从而促进骨形成。     

葛根素对成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的:探讨葛根素(Pue)对高糖培养的成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原m RNA(CollⅠm RNA)表达的影响,为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供实验依据。方法:取出生24 h内的SD大鼠的颅骨,体外分离培养成骨细胞,待细胞形态稳定后,取对数生长期的成骨细胞,随机分为正常组、高糖组(葡萄糖浓度22 mmol/L)、葛根素各浓度组(葛根素浓度分别为10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)、高糖加葛根素各浓度组,每组设8个复孔,分别培养48 h,隔天换液并加药。测定成骨细胞的增殖能力、细胞内ALP活性以及CollⅠm RNA表达情况。结果:与正常组比较,葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠm RNA表达均显著增高,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01);高糖组、高糖+葛根素各浓度组明显低于正常组,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与高糖组比较,高糖+葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠm RNA表达均显著增高,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论:高糖情况下抑制成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达,但加入葛根素后能提高成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达,说明葛根素对糖尿病骨质疏松症有治疗作用。     

补肾益骨方对去势大鼠成骨细胞增殖及BMP-2表达的影响

目的:观察补肾益骨方对去势大鼠成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响。方法:取12周龄Wistar雌性大鼠40只,随机分为A(模型组)、B(治疗组)、C(阳性对照组)、D(正常对照组)四组,每组10只,前3组行完整双侧卵巢摘除术,D组行假手术,术后常规饲养12周,再分别予以生理盐水、补肾益骨方水提液、α-D3水溶液及生理盐水灌胃治疗12周,处死大鼠,取右胫骨上端做病理切片,通过HE染色观察成骨细胞增殖、免疫组化染色观察BMP-2表达。结果:治疗组成骨细胞数量明显增加,而且通过免疫组化染色发现BMP-2棕色深染的阳性细胞比例明显高于模型组。结论:补肾益骨方能促进成骨细胞分化、增殖,加速骨形成,具有治疗骨质疏松的作用。推测骨中BMP-2含量增加是其重要的治疗机理之一。     

健骨二仙丸含药血清对成骨细胞分化及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响

目的:在临床研究和动物实验的基础上,进一步探讨健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响。方法:分离、培养人的原代成骨细胞,采用 PNPP 法、RIA 法、茜素红染色法以及定量 RT-PCR 之法分别检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、矿化结节形成和Ⅰ型前胶原 mRNA 的表达,从而了解健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响。结果:健骨二仙丸中、高剂量能显著增加碱性磷酸酶的活性及矿化结节形成的数量,促进成骨细胞骨钙素和Ⅰ型前胶原 mRNA 的表达(P<0.01,P<0.05),与雌激素(倍美力)组比较差异无显著性。结论:健骨二仙丸能有效促进成骨细胞的分化。     

温阳补肾方含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:探讨温阳补肾方含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响。方法:体外诱导破骨前体细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化,分别用温阳补肾方低、中、高剂量组含药血清和0.9%氯化钠溶液血清干预,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)酶动力法测定各组TRACP活性,实时荧光定量PCR检测温阳补肾方对破骨细胞组织蛋白酶K(Cts K)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA水平。结果:与对照组比较,温阳补肾方含药血清可显著抑制破骨细胞TRACP活性(P<0.01),显著降低破骨细胞骨Cts K、MMP-9 mRNA的表达(P<0.01)。结论:温阳补肾方含药血清可抑制破骨细胞的骨吸收功能,中剂量组效果最佳。     

骨康含药血清对大鼠成骨细胞BMP-2表达的影响

目的:通过观察骨康含药血清对成骨细胞BMP-2表达的影响,探讨其治疗骨质疏松症的作用机制。方法:将6只大白兔随机分为3组:正常血清组、骨康含药血清组和雌二醇含药血清组,分别将血清添加入体外分离、培养的成骨细胞,每组8个样本,采用酶联免疫吸附法,检测成骨细胞BMP-2的表达。结果:骨康含药血清组BMP-2含量显著低于空白对照组(P<0.05),骨康含药血清组与雌二醇含药血清组BMP-2的含量无明显差异。结论:在去势状态下,骨康可能通过促进BMP-2的分泌,达到治疗骨质疏松症的目的。     

骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨骨疏康颗粒含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖及细胞周期分布的影响。方法采用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,制备骨疏康颗粒含药血清干预成骨细胞,以生理盐水大鼠血清作对照,运用MTT法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布。结果与同浓度生理盐水血清比较,骨疏康含药血清能不同程度地促进体外培养成骨细胞增殖,其中以20%骨疏康含药血清促增殖作用最显著,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,且能明显降低G0/G1期细胞比例（P〈0.05）,提高S期成骨细胞比例及增殖指数（P〈0.05）。结论骨疏康含药血清能加速成骨细胞周期,促进成骨细胞增殖。     

骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨骨疏康颗粒含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖及细胞周期分布的影响.方法 采用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,制备骨疏康颗粒含药血清干预成骨细胞,以生理盐水大鼠血清作对照,运用MTT法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布.结果 与同浓度生理盐水血清比较,骨疏康含药血清能不同程度地促进体外堵养成骨细胞增殖,其中以20%骨疏康含药血清促增殖作用最显著,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),且能明显降低G0/G1期细胞比例(P＜0.05),提高S期成骨细胞比例及增殖指数(P＜0.05).结论 骨疏康含药血清能加速成骨细胞周期,促进成骨细胞增殖.     

骨康含药血清对新生大鼠成骨细胞增殖影响的研究

目的：从细胞分子学角度探讨骨康方防治骨质疏松症的作用机理。方法：通过体外分离和培养成骨细胞体系，运用MTT法分别测定骨康含药血清、罗盖全含药血清、空白血清对新生大鼠成骨细胞增殖的影响。结果：用5％和10％的血清培养第7天时三组的0D值均为最高，而20％的血清培养第5天时骨康血清组和罗盖全血清组的OD值最高。结论：骨康含药血清有恒定的促进新生大鼠成骨细胞增殖的作用。实验研究结果^[1]已经证实，骨康方能提高实验动物的骨矿含量和骨密度，改善生物力学性能，调节体内激素水平，具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用。     

骨康含药血清对新生大鼠成骨细胞增殖影响的研究

目的 :从细胞分子学角度探讨骨康方防治骨质疏松症的作用机理。方法 :通过体外分离和培养成骨细胞体系 ,运用MTT法分别测定骨康含药血清、罗盖全含药血清、空白血清对新生大鼠成骨细胞增殖的影响。结果 :用 5 %和 10 %的血清培养第 7天时三组的OD值均为最高 ,而 2 0 %的血清培养第 5天时骨康血清组和罗盖全血清组的OD值最高。结论 :骨康含药血清有恒定的促进新生大鼠成骨细胞增殖的作用。实验研究结果〔1〕已经证实 ,骨康方能提高实验动物的骨矿含量和骨密度 ,改善生物力学性能 ,调节体内激素水平 ,具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用。     

补肾壮骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞增殖及骨保护素mRNA表达的影响

目的:观察补肾壮骨胶囊含药血清对SD大鼠成骨细胞(OB)增殖、骨保护素(OPG)mRNA表达的影响,探讨其防治骨质疏松的机理。方法:将40只3月龄SD雌性大鼠分为补肾壮骨胶囊灌胃组(高、中、低剂量)和空白对照组制备含药血清和空白对照血清;取1天龄SD大鼠颅盖骨,分离、培养成骨细胞(OB),分别加入各实验血清组培养液培养OB,倒置相差显微镜下观察OB生长情况,MTT法测定OB的OD值,RT-PCR检测各组成骨细胞OPGmRNA表达。结果:3-8天时,补肾壮骨胶囊高、中、低含药血清组成骨细胞OD值均高于空白对照组(P<0.05)。各含药血清组成骨细胞OPGmRNA表达均高于空白对照组(P<0.01);补肾壮骨胶囊高、中、低含药血清组间比较,差异无显著意义(P<0.05)。结论:补肾壮骨胶囊含药血清组能促进OB增殖、上调OPGmRNA表达,可能是其防治骨质疏松的机制之一。     

二仙汤及其拆方含药血清对成骨细胞分化的影响

目的:研究二仙汤及其君、臣、佐、使拆方含药血清对成骨细胞分化的影响。方法:实验以成骨细胞系MC3T3-E1细胞为基础,分为空白组、白藜芦醇15mg/kg组、二仙汤整方8g/kg组及依据君臣佐使关系的4个拆方组,即淫羊藿+仙茅3.2g/kg组、淫羊藿+仙茅+巴戟天4.8g/kg组、淫羊藿+仙茅+当归4.8g/kg组、淫羊藿+仙茅+知母+黄柏4.8g/kg组。分别灌胃大鼠,制备含药血清,分别以10%含药血清作用于成骨细胞,以对硝基苯磷酸盐(pNPP)法和碱性磷酸酶(ALP)染色检测成骨细胞ALP活性;以Von Kossa染色法检测成骨细胞矿化结节形成;采用Western blot法检测成骨细胞骨钙素(OC)、骨形成蛋白-2(BMP-2)的表达。结果:与空白组比较,二仙汤整方和各拆方组10%含药血清均能显著增强成骨细胞ALP的活性,其中二仙汤整方组、淫羊藿+仙茅+知母+黄柏组提高成骨细胞ALP活性的作用最为明显,二仙汤整方和各拆方组均可显著提高成骨细胞OC、BMP-2的表达。结论:二仙汤及各拆方含药血清均不同程度地提高成骨细胞ALP活性,增强矿化结节的形成,促进OC、BMP-2的表达,知母、黄柏的作用尤为重要。     

益骨汤含药血清对大鼠成骨细胞骨保护蛋白mRNA表达的影响

目的:观察益骨汤含药血清对大鼠成骨细胞BMP-mRNA表达的影响。方法:制备益骨汤含药血清,取不同浓度剂量来干预体外培养的成骨细胞中BMP-mRNA的相对表达量。结果:益骨汤含药血清能明显增加成骨细胞BMP-mRNA的表达量。结论:益骨汤含药血清能促进成骨细胞表达BMP的作用,从而提高对骨吸收环节抑制作用。     

补肾活血方含药血清通过PI3K/Akt信号通路促进成骨细胞增殖分化研究

目的：观察补肾活血方含药血清对人成骨细胞增殖分化以及PI3K/Akt信号通路的影响,探讨补肾活血方防治骨质疏松症的作用机制。方法：通过新西兰大白兔制备补肾活血方含药血清,将人成骨细胞株分为空白组（Control组）、补肾活血方组（Z组）、补肾活血方含药血清＋10%μmol/L的抑制剂LY294002组（Z＋LY组）,采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各组成骨细胞的增殖情况,生化方法检测成骨细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性,Western blot法检测AKT的活化情况。结果：补肾活血方含药血清能促进成骨细胞的增殖,并使之分化增强,且较Control组差异有统计学意义（P〈0.01）;阻断PI3K/AKT信号通路后,Z＋LY组对成骨细胞增殖分化的抑制较Z组差异有统计学意义（P〈0.05）,且对成骨细胞的分化功能有显著抑制作用（P〈0.01）;Western blot结果显示,补肾活血方含药血清能促进磷酸化AKT（p-AKT）的表达,用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后,p-AKT表达含量明显减少（P〈0.01）。结论：补肾活血方可能通过PI3K/Akt信号通路促进成骨细胞的增殖,并促进成骨细胞分化功能,这可能是补肾活血方防治骨质疏松症的机制之一。     

二仙汤含药血清对过氧化氢诱导成骨细胞骨形成的影响

目的探讨二仙汤治疗骨质疏松症的可能作用机制。方法成骨细胞以5×103/孔接种于96孔板,分为正常组、模型组、戊酸雌二醇组和二仙汤高、中、低剂量组,每组6孔。除正常组外其余各组用含600μmol/L过氧化氢(H2O2)的完全培养基培养3h诱导成骨细胞骨形成模型。正常组用空白对照血清培养,戊酸雌二醇组给予8%戊酸雌二醇含药血清培养,二仙汤高、中、低剂量组分别给予8%、4%、2%二仙汤含药血清培养48h,检测成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活力、钙结节生成以及骨形成蛋白2(BMP-2)和骨保护素(OPG)蛋白表达。另外以钙离子通道阻断剂Nifdipine(10μmol/L)进行干预,观察Nifdipine对H2O2刺激成骨细胞后细胞增殖、ALP活性及BMP-2、OPG蛋白表达以及Nifdipine干预下二仙汤含药血清对H2O2刺激成骨细胞后细胞增殖、ALP活性及BMP-2、OPG蛋白表达的影响。结果与正常组比较,模型组细胞增殖、ALP活性、钙结节及BMP-2表达降低(P0.05或P0.01)。二仙汤各剂量组能不同程度促进成骨细胞增殖,提高ALP活力和钙结节生成,促进BMP-2、OPG蛋白表达(P0.05或P0.01)。Nifdipine能提高H2O2刺激下成骨细胞BMP-2、OPG蛋白表达(P0.05或P0.01)。与Nifdipine组比较,二仙汤含药血清和Nifdipine合用则显著提高H2O2刺激下的成骨细胞增殖,降低BMP-2、OPG蛋白表达(P0.01)。结论二仙汤含药血清能明显改善氧化刺激对成骨细胞骨形成的影响,其机制可能与调节钙离子通道有关。     

葛根素对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响

目的:探讨葛根素对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响。方法:采用血清药理学方法制备葛根素含药血清,分为葛根素组、阳性对照组和阴性对照组。从SD大鼠乳鼠颅骨获取成骨细胞,分别用含药血清培养分离得到的成骨细胞。采用CCK-8检测成骨细胞增殖、酶联免疫吸附试验检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达;采用微量酶标法检测碱性磷酸酶的活性。结果药物作用24、48和72 h后,葛根素组D值显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。随着时间的增加,葛根素组和阳性对照组D值在药物作用48 h达到最高,至72 h后有下降趋势。药物作用3 d和7 d后,葛根素组BMP-2表达水平均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。药物作用3d和7 d后,葛根素组BMP-2表达水平均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。药物作用3 d和7 d后,葛根素组碱性磷酸酶活性均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。结论葛根素可能通过诱导BMP-2表达促进增殖,活化碱性磷酸酶活性促进生物矿化。     

补肾方药对骨质疏松大鼠骨基质Ⅰ型胶原表达的影响

目的 :探讨补肾方药预防糖皮质激素诱导大鼠骨质疏松发生的机制。方法 :通过肌肉注射地塞米松造成骨质疏松模型 ,观察补肾中药对骨密度的影响 ,从骨骼中提取 m RNA,采用 RT- PC方法对 型胶原m RNA进行半定量。结果 :病理组大鼠的骨密度及骨骼中 型胶原 m RNA的表达明显降低 ( P<0 .0 5) ,而补肾方药组的骨密度及 型胶原 m RNA的表达明显高于地塞米松组 ( P<0 .0 5)。结论 :地塞米松抑制 型胶原 m RNA在骨骼的表达 ,补肾方药可通过提高 型胶原 m RNA在骨的表达而预防骨质疏松的发生。     

抗癌Ⅰ号方含药血清对HepG 2肝癌细胞增殖抑制的影响

目的研究抗癌Ⅰ号方含药血清对HepG2肝癌细胞的抑制作用及其可能机制。方法用MTT法检测不同浓度的抗癌Ⅰ号方含药血清对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用。免疫印迹法检测各浓度组48h PI3K/Akt信号通路重要蛋白Akt及其磷酸化形式p-Akt的蛋白水平。结果不同浓度的抗癌Ⅰ号方含药血清对HepG2肝癌细胞均有抑制作用,且有一定的浓度依赖性。随着浓度升高,p-Akt/Akt值呈降低趋势,差异有统计学意义(P 0.05)。结论抗癌Ⅰ号方含药血清对HepG2肝癌细胞增殖起抑制作用,同时与药物浓度有一定的依赖性,其可能通过抑制PI3K/Akt通路激活实现。     

健脾补肾方含药血清对体外培养小鼠脾细胞周期影响

[目的]观察健脾补肾方含药血清对体外培养小鼠脾细胞周期影响。[方法]用血清药理学方法,流式细胞仪技术检测健脾补肾方含药血清对体外培养48h后小鼠脾细胞DNA周期影响。[结果]健脾补肾方含药血清高浓度组DNA合成前期细胞百分比显著低于对照组,差异具有显著性(P<0.01),并且含药血清各浓度组DNA合成期(S期)细胞均高于对照组(P<0.01),而DNA合成后期及有丝分裂期(G2/M期)细胞只有高浓度组显著高于对照组(P<0.01)。[结论]健脾补肾方含药血清可以促进小鼠脾细胞的增值。     

补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞miRNA的差异表达

目的筛选补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞后差异表达的miRNA,为补肾方治疗颈椎病提供可供选择的目标miRNA,以探讨其通过调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法原代培养的大鼠椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色鉴定后,分别用补肾方含药血清、空白血清干预椎间盘软骨细胞,在给定时间点收获细胞,抽提纯化总RNA,行miRNA芯片检测,通过芯片差异性分析,挑选差异表达4倍以上的miRNA行定量聚合酶链式反应(PCR)验证。结果二次酶消化法可简便高效培养大量原代椎间盘软骨细胞,所培养细胞具有典型的椎间盘软骨细胞形态和功能,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色均为阳性。补肾方含药血清干预组芯片数据分别与相应时间点的空白血清组芯片数据行组间比较后再行组内比较,与含药血清干预椎间盘软骨细胞1 d相比,干预3 d的共有121个2倍以上表达差异的miRNA,其中上调的53个,下调的68个。差异表达4倍以上的miRNA定量PCR结果与芯片数据一致。结论补肾方含药血清干预椎间盘软骨细胞获得了一套较为特异的miRNA,初步预测上调的miRNA可能通过靶向Opn、Col、Bcl212、Vdr、IGF-I、Mmp-13等基因在椎间盘营养代谢相关信号通路中发挥作用。