千里光橙花叔醇合酶SsNES的功能鉴定北大核心CSCD

通过对千里光转录组数据筛选得到一个较短的萜类合酶基因。对其进行系统进化树和序列比对分析,初步确定为一个橙花叔醇合酶,命名为SsNES (GenBank登录号MH518312)。通过蛋白同源建模表明SsNES虽然序列较短,但具有完整的保守功能域,并且能正确折叠。通过对该基因的克隆,原核表达载体的构建,成功在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白;用大肠杆菌代谢工程鉴定SsNES的体外催化功能,结果表明SsNES可以催化反式法尼烯焦磷酸(FPP)生成反式橙花叔醇。在千里光茎叶的提取物中也检测到反式橙花叔醇,表明该基因作为橙花叔醇合酶在千里光中行使功能;通过RT-PCR表达模式的分析,SsNES在茎中表达最高,其次是花、叶,在根中不表达;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、丙甲菌素(Ala)的处理后该基因均能在6 h时就被诱导表达,表明该基因可能参与到千里光应对胁迫响应的防御过程中。SsNES生化功能的鉴定不仅为倍半萜合酶的研究提供多样性,也解析了千里光中橙花叔醇的生物合成,为千里光萜类化合物介导的病虫害防御提供理论基础。     

GC测定降香油中氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇的含量

目的: 建立降香油中氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇含量测定方法,并比较不同批号的降香油中氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇的含量. 方法: 采用气相色谱法,DB-Wax弹性石英毛细管柱(250 μm×30 m,0.25 μm),以FID检测器,内标为萘. 结果: 降香油中氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇的含量分别为16%~20%,19%~25%,25%~30%,氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇分别在0.018 96~0.113 73,0.019 01~0.114 06,0.013 02~0.078 09 g·L^-1呈良好的线性关系,平均回收率分别为98.10%,98.79%,98.95%. 结论: 采用气相色谱法测定降香油中氧化橙花叔醇Ⅰ、氧化橙花叔醇Ⅱ、反式橙花叔醇含量,方法简单、可行.7个批号的降香油的含量差别不大.     

高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建

橙花叔醇为萜类精油成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇,该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶(NES)基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP-001中获得工程菌株NES-001,其橙花叔醇产量达到2.71 mg·L~(-1)。在进一步工作中,橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS融合法尼烯合酶(FPS)后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES-002,其产量是NES-001的59.80倍,达到162.07 mg·L~(-1)。最终,通过恢复NES-002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES-003,该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 711.53 mg·L~(-1)。该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。     

HPLC法测定降香挥发油中橙花叔醇的含量

降香挥发油是从豆科常绿小乔木降香檀Dalbergia odorifera T.Chen的树干和根部干燥心材提取得到的，它可提高血小板cAMP含量，具有抑制血栓形成的作用，利用降香挥发油开发研究新剂型有很高的社会和经济价值。国内外关于降香挥发油化学成分的研究报道较少，国外曾有自同属植物D．parviflora Roxb.木材中得到橙花叔醇、微量糖醛及一种可能是金合欢醇的成分。但各种研究报道都是用气相色谱法或GC-MS法，尚未见有用HPLC法测定降香挥发油中橙花叔醇含量的报道。本实验以降香挥发油的主要成分橙花叔醇为指标，建立了HPLC测定方法，测定了用水蒸气(steam distillation，SD)及CO2超临界萃取(supercritical CO2fluid extraction,SFE-CO2)两种方法提取的挥发油中橙花叔醇的含量，为降香挥发油的综合利用提供了客观的定量评价。     

GC法测定降香油中橙花叔醇的含量

降香为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T．Chen树干和根的干燥心材，性温、味辛，归肝、脾经，能行气活血、止痛、止血，用于脘腹疼痛，肝郁胁痛、胸痹刺痛、跌打损伤、外伤出血等症。为控制降香油质量，本实验采用GC法对降香药材经超临界CO2萃取所得的降香油中有效成分之一橙花叔醇进行测定。该法灵敏、简便、准确和重现性好，可作为该原料的质量控制。     

HPLC法测定降香油中反式-橙花叔醇含量

目的:建立HPLC法测定降香油中反式-橙花叔醇含量的方法。方法:采用迪马DiamonsiLTMC18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm);以甲醇-水(15:85)为流动相;流速为1.0mL.min-1;检测波长为213nm;柱温:30℃。结果:反式-橙花叔醇在0.10～1.0mg.mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.9998),平均加样回收率(n=9)为99.3%,RSD为0.9%。结论:所建立的方法准确、快速,操作简便,可用于降香油的质量控制。     

RP-HPLC测定降香煎剂中橙花叔醇含量及变化

目的:建立对降香中橙花叔醇含量随煎煮时间变化的分析方法。方法:采用高效液相色谱法,以甲醇:水为流动相(78:22),检测波长:213nm,体积流速:1.2ml/min,柱温:室温,检测降香沸水后下时每间隔1 min所取水煎液样品中橙花叔醇的含量。结果:在煮沸后20min内,橙花叔醇含量呈上升趋势,在2.8min时达到相对高点;之后,呈下降趋势。结论:沸腾后仍用文火继续煎煮约2.8min时降香中的橙花叔醇的含量相对较高。     

管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析

目的 研究管花肉苁蓉Cistanche tubulosa花中查耳酮合酶（chalcone synthase）Ct CHS蛋白的功能和Ct CHS基因在白、红、紫3种颜色花中的表达模式。方法 利用RT-PCR克隆Ct CHS基因并进行生物信息学分析。将p ET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌通过IPTG诱导蛋白表达。将Ct CHS重组蛋白与底物4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A孵育并利用HPLC和MS检测产物。将p CAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转入拟南芥原生质体观察CtCHS蛋白亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Ct CHS基因在3种颜色管花肉苁蓉花中的表达模式。结果 克隆出1条Ct CHS基因,开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为1173 bp,编码390个氨基酸,蛋白相对分子质量为42 800,具有查耳酮合酶保守的催化残基Cys164、His303、Asn336。利用大肠杆菌外源表达Ct CHS蛋白并纯化获得重组蛋白。Ct CHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮。Ct CHS蛋白主要定位于细胞质。Ct C...     

柱切换色谱法同时测定香丹注射液中水溶性成分及橙花叔醇的含量

目的：采用柱切换程序进样高效液相色谱法对香丹注射液中高含量水溶性成分(丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B)及微量挥发性成分橙花叔醇(含量相差近3个数量级)的含量进行测定。方法：以Agilent SB-C18预柱为预处理柱，Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为分析柱；预处理流动相为1%醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速0.5 mL·min-1；分析流动相为0.05%醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1；检测波长：0 min，280 nm，40 min，210 nm；柱温40 ℃；进样程序及进样量为：0 min，10 μL供试品溶液1；15.3 min，200 μL供试品溶液2。结果：丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇在实验浓度范围内线性关系良好(R2≥0.999 0)；平均加样回收率在100%～102%，RSD小于3.0%；丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇的检出限分别为17.1，0.473，60.2，50.6 μg·L-1。结论：方法简便、灵敏，重复性与加样回收率良好，可用于香丹注射液质量分析。     

HPLC法同时测定冠心丹参胶囊中丹参酮ⅡA和橙花叔醇的含量

目的：建立一种HPLC方法同时测定冠心丹参胶囊中丹参酮ⅡA和橙花叔醇的含量。方法：采用HPLC法,色谱柱为Kromasil—C18（4．6mm×250mm,5um）柱,流动相：以甲醇-水（80：20,v：v）为流动相;流速：1．0mL／min;柱温：30℃;检测波长：280nm（0～18．5分钟）→213nm（18．5～25分钟）。结果：丹参酮ⅡA和橙花叔醇线性范围分别为1．656～13．248ug／mL（r=0．99999）和12．76～102．08ug/mL（r=0．99997）,平均加样回收率分别为98．70％（RSD=0．66％）和98．21％（RSD=1．53％）。结论：新建方法简便、准确、易行,可用于控制冠心丹参胶囊制剂质量。     

北柴胡β-香树脂醇合酶基因家族成员鉴定及功能验证

目的 从转录组层面对北柴胡Bupleurum chinense β-香树脂醇合酶（β-amyrin synthase,β-AS）基因家族成员进行鉴定,并对其表达及功能进行分析验证,以期为解析柴胡皂苷的合成和调控提供基础。方法 基于全长转录组数据挖掘北柴胡β-AS基因家族成员（BcBASs）,利用在线软件对各基因进行生物信息学分析,利用大肠杆菌和烟草验证关键基因的功能。结果 从北柴胡转录组数据中挖掘到不冗余的β-AS基因6个,可分为3个亚家族,它们都具有典型保守区域DCTAE、MWCYCR和QW。进化分析表明,BcBAS1、BcBAS2、BcBAS4、BcBAS5、BcBAS6可能为单功能β-AS基因,BcBAS3可能为多功能β-AS基因,表达分析表明各基因在根和叶中的表达模式有差异。在大肠杆菌中成功表达了BcBAS1可溶性重组蛋白,相对分子质量约87 000,烟草瞬时表达表明BcBAS1编码蛋白具有β-AS功能,能促进β-香树脂醇的积累。结论 对北柴胡中6个不冗余的β-AS基因家族成员进行了鉴定和生物信息学分析,获得了BcBAS1可溶性重组蛋白,在烟草中验证了BcBAS1为有功能的β-AS,为柴胡皂苷合成调控机制和生物合成研究奠定了基础。     

一个紫芝多产物倍半萜合酶的功能鉴定

目的:紫芝是我国最著名的药用真菌之一,作为担子菌亚门的模式药用真菌,其倍半萜合酶的功能鉴定对真菌倍半萜的生物合成与调控研究具有重要意义。方法:通过挖掘紫芝基因组数据发现一个灵芝倍半萜合酶基因,将其与已经鉴定的两个紫芝倍半萜合酶和非冗余蛋白数据库(Nr数据库)中与其同源性最高的3个萜类合酶进行多重序列比对分析其保守结构域。然后,在大肠埃希菌中进行异源表达,通过SDS-PAGE对其蛋白表达情况进行检测。利用固相微萃取收集挥发性物质,并通过GC-MS对其产物进行检测。结果:该酶含有倍半萜保守基序DDXXDE和NSE/DTE,可在大肠埃希菌中可溶性表达,GC-MS分析发现,该酶可以内源性法尼基焦磷酸(FPP)为底物合成11种倍半萜类化合物,出峰时间为18. 6 min的产物α-cadinol是主要产物,已有研究表明α-cadinol具有明显的抗癌活性。通过与对照品比对进一步确定其中3个产物分别是γ-muurlene,α-muurolene和δ-cadinene。结论:紫芝多产物倍半萜合酶的功能鉴定可推动其产物多样性的形成机制研究,为通过酶工程技术改良酶的催化活性生产稀有或新型倍半萜类化合物奠定基础。     

千里光与单头紫菀的外形鉴定

千里光为菊科植物千里光Senecio scandens Buch,.-Ham．的干燥全草。别名九里明、九龙光、黄花草、九岭光。本品原名千里及，始载于《本草拾遗》。《植物名实图考》曰：“千里及，《本草抬遗》始著录，《图经》千里光、千里及，形状如一，李时珍并之，良是。”具有清热，解毒，杀虫，明目之功。治各种急性炎症性疾病，如：风火赤眼，目翳，伤寒，菌痢，大叶肺炎，扁桃体炎，肠炎，黄疸，流行性感冒，毒血症，败血症，痈肿疖毒，干湿癣疮，丹毒，湿疹，烫伤，滴虫性阴道炎等证。现浙江有用单头紫菀的全草代替千里光入药。单头紫菀是浙江民间草药，为菊科植物陀螺紫菀Aster turbinatus S．Moore的干燥全草。别名喉风草，百条根、牛舌草、打风草、野白菊、一枝香。临床上用于清热解毒，止痢止痒。笔者以外形鉴定的方法来区别千里光和单头紫菀两种药材。     

丹参萜类合酶基因家族的鉴定和表达模式分析

目的 利用生物信息学方法从基因组层面对丹参萜类合酶（SmTPS）基因家族成员进行全面鉴定和功能预测。方法 从国家基因组科学数据中心（NGDC）、美国国家生物技术信息中心（NCBI）、拟南芥信息资源中心（TAIR）和番茄功能基因组学数据库（TFGD）分别获取丹参、拟南芥和番茄基因组与转录组数据。借助Perl语言、TBtools等工具对SmTPS进行全基因组鉴定与生物信息学分析。结果 共鉴定出52个TPS成员分布在丹参的8条染色体上；编码氨基酸数目在207~822 aa；等电点在4.76~9.16，分子质量为24.11~94.81 kDa，所有成员均为亲水蛋白。基因结构分析表明不同亚族成员之间内含子数差异明显，72.6% TPS-a、TPS-b、TPS-g亚族成员为6，88.9% TPS-c、TPS-e/f亚族成员>10；蛋白motif相对保守。顺式作用元件分析表明，SmTPSs启动子区均含有大量光响应元件，大多数SmTPSs启动子区含有激素响应元件。基因表达模式分析显示SmTPS家族成员存在组织表达特异性，24个基因响应外源茉莉酸甲酯。结论 基于已发表丹参基因组，鉴定得到52个SmTPS家族成员，结合系统进化与表达模式对其功能进行了预测。该文为丹参中萜类化合物生物合成及调控机制全面解析提供了参考信息。     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

金铁锁β-香树素合酶cDNA的克隆、原核表达和功能鉴定

目的 克隆金铁锁Psammosilene tunicoides三萜皂苷生物合成途径中的关建酶基因——β-香树素合酶全长cDNA,并对其进行表达和分析,为研究其在三萜皂苷合成途径的关键作用及次生代谢产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础。方法 应用RT-PCR和RACE等方法,克隆金铁锁β-香树素合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,以2,3-氧化鲨烯为底物进行体外酶促,采用HPLC法鉴定产物。结果 克隆得到金铁锁β-香树素合成酶基因,全长2 882 bp,ORF长2 284 bp,编码760个氨基酸。表达产物具有催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素合酶的活性。结论 克隆所得的全长cDNA通过大肠杆菌表达β-香树素合酶,并能催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要的基础。     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

樟树化学型形成关键萜类合酶的系统鉴定

樟树Cinnamomum camphora为我国重要的经济树种。根据叶片挥发油中主要成分的种类和含量,樟树通常被分为龙脑型、樟脑型、芳樟醇型、桉叶油型和橙花叔醇型5种化学型,萜类合酶(terpene synthase, TPS)是形成这些化合物的关键酶。虽然多个关键酶基因已得到鉴定,但最具经济价值的(+)-龙脑的生物合成途径未见报道。该研究通过对4种化学型叶片的转录组分析,克隆了9个萜类合酶基因CcTPS1～CcTPS9。经过大肠杆菌诱导表达重组蛋白后分别以香叶基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行酶促反应,结果CcTPS1和CcTPS9均可催化GPP生成冰片基焦磷酸,并在磷酸水解酶的作用下得到(+)-龙脑,产物占比分别为0.4%、89.3%。CcTPS3和CcTPS6均可催化GPP生成单一产物芳樟醇,CcTPS6还可与FPP反应生成橙花叔醇。CcTPS8与GPP反应生成1,8-桉叶油(30.71%)。9个萜类合酶共计产生9个单萜和6个倍半萜类化合物。该研究首次确定樟树中负责(+)-龙脑生物合成的关键酶基因,为进一步阐明化学型形成的分子机制及利用生物工程技术培育高产龙脑新...     

千里光过氧化物酶基因的SSR标记及序列分析

目的研究千里光过氧化物酶(peroxidase,POD)基因结构特征和功能的关系,并根据其核苷酸序列设计SSR引物,进一步验证其在多个千里光地方种中的多态性。方法从千里光全长c DNA文库中分离到POD全长序列,运用系列生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸的序列特征分析,分析序列中的SSR位点并对多个千里光品系进行PAGE检测和验证。结果基因具有典型的POD结构特征,表现出高度的保守性。PAGE电泳显示该引物在不同地方品系的千里光中扩增稳定,且存在明显多态性。结论研究结果拓展了对千里光POD基因序列和功能的认识,新开发标记能有效应用于POD基因的检测和育种鉴定,同时也可为其他物种的POD研究提供参考。     

灯盏花中两个新化合物的分离和鉴定

目的 探索菊科植物灯盏花Erigeron breviscapus的化学成分。方法 采用各种色谱分离技术,理化常数和光谱分析鉴定了化合物的结构。结果 从灯盏花的乙醇提取物中分得了2个化合物,经光谱学分析鉴定它们的结构分别为：1－羟基－2,3,5－三甲氧基Shan酮（1－hydroxy-2,3-5-trimethoxy xanthone,Ⅴ）,1－（2‘-γ-吡喃酮）－6－咖啡酰基－α-D-吡喃葡萄糖苷（1,2‘-γ-pyranone)-6-caffeoyl-α-D-pyranoglucose,Ⅵ）。结论 化合物Ⅴ、Ⅵ,为新化合物。化合物Ⅵ对TNF－α诱导的内皮细胞粘附有一定的抑制作用。提示它对缺血再灌注损伤有保护作用。