茶多酚调节STAT3/miR-126/端粒信号通路活性延缓高糖诱导的人肾小球系膜细胞衰老

探讨茶多酚(tea polyphenols,TP)在体外高糖环境下延缓人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells,HGMCs)衰老的作用及可能的机制。在体外培养HGMCs,分为正常组(normal group,N,5.5 mmol·L^-1葡萄糖)、甘露醇组(mannitol group,MNT,5.5 mmol·L^-1葡萄糖+24.5 mmol·L^-1甘露醇)、高糖组(high dose of D-glucose group,HG,30 mmol·L^-1葡萄糖)、低剂量TP组(low dose of TP group,L-TP,30 mmol·L^-1葡萄糖+5 mg·L^-1 TP)及高剂量TP组(high dose of TP group,H-TP,30 mmol·L^-1葡萄糖+20 mg·L^-1 TP),分别在37℃,5%CO2条件下培养,干预72 h后,首先观察TP对HGMCs形态的影响;其次,检测细胞周期、衰老相关半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色阳性率、端粒长度;最后,检测p53-p21-Rb信号通路中关键信号分子p53,p21,Rb的蛋白表达水平及p-STAT3,miR-126的表达水平。结果表明,高糖能诱导HGMCs衰老,不仅表现为细胞周期阻滞于G1期、SA-β-gal染色阳性率升高、端粒长度缩短,还表现为p53,p21,Rb蛋白表达水平升高和p53-p21-Rb信号通路激活。L-TP能延缓HGMCs衰老,不仅表现为HGMCs细胞周期G1期阻滞的改善、SA-β-gal染色阳性率的下降、端粒长度的延长,还表现为p53,p21,Rb蛋白表达水平的下降,端粒-p53-p21-Rb信号通路活性的抑制。此外,高糖诱导HGMCs p-STAT3表达水平上调、miR-126表达水平下调,而L-TP可使这些变化得到改善。总之,高糖能激活端粒-p53-p21-Rb信号通路而诱导HGMCs衰老;L-TP能调节STAT3/miR-126表达水平,抑制端粒-p53-p21-Rb信号通路活性而延缓高糖诱导的HGMCs衰老。这些发现为临床上防治糖尿病肾病相关的肾脏细胞衰老提供了有效的干预措施。     

梓醇对衰老大鼠肾脏组织SIRT1基因表达的影响

目的:研究梓醇对衰老大鼠肾脏组织沉默信息调节因子1(SIRT1)基因表达的影响。方法:选取Wistar雄性3月龄大鼠10只作为青年组,24月龄大鼠50只随机分为老年组、维生素E组、梓醇低、中、高剂量组。青年组、老年组灌胃生理盐水,维生素E组灌胃维生素E混悬液,梓醇低、中、高剂量组分别按10、50、100 mg/kg·d-1腹腔注射梓醇生理盐水溶液。干预60 d后,检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr),PAS法观察肾脏病理学改变,观察衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色,检测过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量,RT-PCR法检测SIRT1 mRNA表达,Western-blot法测定SIRT1蛋白表达,并进行比较。结果:梓醇中、高剂量组大鼠BUN、Cr显著下降;肾小球硬化、肾小管萎缩、系膜基质增厚、炎性细胞浸润情况明显改善;肾小球、肾小管、小球旁毛细血管衰老相关SA-β-gal活性染色减少;H2O2、MDA含量均显著降低;SIRT1基因mRNA和蛋白表达显著升高。梓醇中、高剂量组之间无明显差异。结论:梓醇可能通过干预SIRT1基因表达延缓大鼠肾脏衰老。     

人参皂苷Rg_1对D-半乳糖所致衰老小鼠海马的保护机制

目的探讨人参皂苷Rg_1对D-半乳糖(D-gal)所致衰老小鼠海马的保护机制。方法 6~8周龄雄性C57BL/6J巢蛋白(Nestin)-绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠随机分为4组,每组10只,分别为对照组、人参皂苷Rg_1对照组、人参皂苷Rg_1治疗组、模型组。衰老模型建立与给药完成后第2天,水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力;取小鼠海马制备冷冻组织切片,观察海马区神经干细胞Nestin荧光强度;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测海马细胞衰老;酶标比色法检测海马组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的量;ELISA检测海马组织匀浆中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量;蛋白印迹法检测海马组织中p53、p21蛋白表达。结果与模型组比较,人参皂苷Rg_1对照组和人参皂苷Rg_1治疗组小鼠空间学习记忆能力明显增强;海马齿状回(DG区)Nestin荧光强度增高;海马齿状回(CA3区)SA-β-gal染色阳性细胞百分比显著降低;海马组织匀浆中SOD活性与T-AOC显著增加、MDA量下降;IL-1β、IL-6和TNF-α量减少;p53、p21蛋白表达降低。结论人参皂苷Rg_1具有拮抗D-gal所致衰老小鼠海马损伤和延缓海马衰老的作用,其机制可能与抑制氧化应激及下调其下游p53-p21信号通路有关。     

人参-三七-川芎提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的影响

目的:观察益气活血中药人参、三七、川芎提取物延缓高糖高脂诱导的血管内皮细胞衰老的分子生物学机制。方法:采用40 mmol·L~(-1)葡萄糖和100μmol·L~(-1)棕榈酸钠造模,实验分为空白组、模型组和中药低、中、高剂量组(50,100,200 mg·L~(-1)),干预48 h。采用细胞增殖与活性检测(CCK-8)检测细胞增殖能力;细胞衰老β-半乳糖苷酸(SA-gal)染色检测细胞衰老程度;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞p16,p21蛋白表达水平的变化;免疫荧光检测p-H2A.X(Ser139)表达,线粒体ROS(mtROS)产生和线粒体膜电位(MMP)改变。结果:与空白组比较,模型组细胞增殖能力及MMP水平降低(P 0. 01),SA-β-gal蓝染细胞数量,mtROS生成和p16,p21,p-H2A.X(Ser139)表达增加(P 0. 05,P 0. 01);而与模型组比较,人参-三七-川芎提取物可提高细胞增殖能力和MMP水平(P 0. 01),减少SA-β-gal蓝染细胞数量和mtROS生成(P 0. 01),并能够降低p16,p21和p-H2A.X(Ser139)的表达水平(P 0. 05,P 0. 01)。结论:益气活血中药人参-三七-川芎提取物能够延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老,其机制可能与升高线粒体膜电位,减少ROS生成引起的DNA损伤累积有关。     

人参三七川芎提取物延缓内皮细胞复制性衰老的机制研究

目的:探讨人参三七川芎提取物对内皮细胞复制性衰老(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影响.方法:体外培养的HUVEC-2C传代至第8代,造成内皮细胞复制性衰老模型.细胞分为4组,8代衰老模型组、维生素E(Vit E)组(50 mg·L~(-1))、中药高、低(50,20 mg·L~(-1))剂量组,采用衰老相关卢β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量,硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(NO)和抗超氧阴离子水平,Western-blot法检测各组细胞AngII1型和2型受体(AT_1R和AT_2R),NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达.结果:8代衰老模型组β-gal染色阳性细胞数明显增多,细胞停滞在G_0/G_1期,激光共聚焦显微镜下ROS荧光强度明显增强,培养液中抗超氧阴离子、NO含量减少,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达上调.给予高、低剂量中药处理后,可明显改善细胞的衰老状态,β-gal染色阳性细胞数减少,G_0/G_1期细胞减少,G_2/M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较8代衰老模型组增加,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论:人参三七川芎提取物能够延缓内皮细胞复制性衰老,通过活性氧途径下调NADPH氧化酶p47phox的表达,最终使ROS产生减少;同时,中药提取物还能降低衰老内皮细胞AT_1R,AT_2R的表达,改善内皮功能,这可能是益气活血中药延缓内皮细胞衰老的主要原因之一.     

三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究三七皂苷(PNS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的大鼠肾小管细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用,并从沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/TGF-β_1/Smad通路分析其可能机制。方法:在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常组,TGF-β_1组(5μg·L~(-1)),白藜芦醇组(50 mg·L~(-1)),SIRT1阻断剂EX527组(10μmol·L~(-1)),PNS组(100 mg·L~(-1)),EX527+PNS组(EX527 10μmol·L~(-1),PNS 100 mg·L~(-1)),48 h后收集细胞;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测SIRT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏附蛋白(E-cadherin),TGF-β_1,Smad3,Smad4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,α-SMA,E-cadherin,TGF-β_1蛋白表达。结果:与正常组比较,TGF-β_1组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P 0. 05),E-cadherin表达显著减少(P 0. 01);与TGF-β_1组比较,PNS,白藜芦醇组,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著增加(P 0. 01),α-SMA表达显著减少(P 0. 01),EMT发生被抑制,同时,SIRT1表达显著增加(P 0. 01),TGF-β_1,Smad3,Smad4表达显著降低(P 0. 01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS则不能发挥明显抑制作用。结论:PNS可以阻止TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,其机制可能是通过激活SIRT1进而抑制TGF-β_1/Smad通路实现的。     

人参皂苷Rg1延缓造血干细胞衰老与 p16INK4a表达关系的研究

目的:探讨人参皂苷单体Rg1延缓造血干细胞(HSC)衰老与p16INK4a的表达调控关系,为寻找延缓HSC衰老途径提供理论和实验依据.方法:免疫磁性分选法分离纯化Sca-1+HSC后分组.对照组常规培养;衰老组运用三丁基过氧化氢(t-BHP)复制衰老模型;Rg1组在对照组基础上加入10μmol·L-1Rg1共培养;Rg1延缓衰老组给予10μmol·L-1Rg1预处理后,复制衰老模型;Rg1治疗衰老组,衰老模型复制后,给予10μmol·L-1Rg1抗衰老处理.衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)细胞化学染色、流式细胞术分析细胞周期和造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养确定Rg1延缓或治疗Sca-1+HSC衰老生物学作用.RT-PCR及Western blotting检测衰老相关基因pl6INK4amRNA及蛋白的表达.结果:Rg1延缓衰老组,Rg1治疗衰老组与衰老组相比,SA-β-gal染色阳性细胞百分比降低,G1期细胞比例下降,生成造血祖细胞混合集落数增加,p16INK4amRNA及蛋白的表达下降;Rg1延缓衰老组的SA-β-gal染色阳性细胞百分比、G1期比例、pl6INK4amRNA及蛋白的表达均低于Rg1治疗衰老组,形成造血祖细胞混合集落数高于Rg1治疗衰老组.结论:Rg1具有延缓和治疗Sca-1+HSC衰老的作用,Rg1延缓衰老比治疗衰老效果更好.Rg1可能通过调控p16INK4a的表达发挥其对抗t-BHP诱导的Sca-1+HSC衰老的作用.     

人参三七川芎提取物对复制性衰老内皮细胞的影响和钙黏蛋白的作用

目的:观察人参三七川芎提取物对复制性衰老人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)的影响和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的作用。方法:以HCMEC为研究对象,第8代HCMEC建立复制性衰老HCMEC模型,实验分为衰老模型组(衰老组)、白藜芦醇组(10μmol·L-1)、人参三七川芎低、中、高剂量组(50,100,200 mg·L-1),相应药物作用24 h后,采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)衰老染色鉴定,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,采用激光免疫共聚焦显微镜观察VEcadherin的形态学改变,Western blot检测VE-cadherin蛋白的表达情况。结果:与衰老组比较,人参三七川芎提取物各剂量组减少SA-β-gal衰老染色比例,促进细胞的增殖,减少G0/G1期细胞比例,增加G2/M期细胞比例,保持VE-cadherin形态的完整性,升高VE-cadherin蛋白的表达,均具有明显的统计学差异(P0.05,P0.01)。结论:人参三七川芎提取物能够延缓衰老,促进增殖和有丝分裂,保持复制性衰老HCMEC VE-cadherin的完整性和蛋白的表达,这可能是益气活血中药延缓内皮衰老的重要机制所在。     

肝豆汤对Wilson病模型高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应的影响及其作用机制

目的:研究肝豆汤对高铜诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞自噬效应的影响及其作用机制,为中医药防治脑型Wilson病(Wilson disease,WD)提供新的治疗靶点和研究思路。方法:噻唑蓝(MTT)比色法筛选硫酸铜(CuSO_4)造模浓度(0,100,200,400,800,1 600μmol·L-1)及时间; MTT比色法筛选含药血清浓度(5%,10%,15%,20%)及时间;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞LDH漏出率;流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS)的含量;荧光染料JC-1检测细胞线粒体膜电位;流式细胞仪对自噬进行定量分析。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝激酶B1(LKB1),腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),自噬微管相关蛋白轻链3A/B(LC3A/B),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),unc-51样激酶1(ULK1),磷酸化ULK(p-ULK),磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白的表达。结果:MTT结果显示,CuSO_4对细胞的损伤呈现一定的量效和时效关系(P 0. 01),随着CuSO_4作用浓度及时间的增加,细胞存活率呈现下降趋势; 10%含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞死亡(P 0. 01)。LDH释放实验显示,与正常组比较,CuSO_4作用细胞后LDH漏出率显著增加(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显降低CuSO_4损伤细胞的LDH漏出率(P 0. 05)。DCFH-DA荧光染色显示,与正常组比较,CuSO_4可显著增加细胞内ROS生成(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞内ROS产生(P 0. 01)。JC-1染色结果显示,与正常组比较,CuSO_4诱导细胞线粒体膜电位Δψm显著降低(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显抑制CuSO_4诱导的线粒体膜电位降低Δψm(P 0. 05)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组细胞内LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白的表达显著增加,mTOR及p-ULK蛋白的表达显著降低(P 0. 01)。与模型组比较,含肝豆汤兔血清组LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白表达显著降低,mTOR及p-ULK蛋白表达显著增加(P 0. 01)。结论:高铜可通过诱导细胞内线粒体氧化应激,上调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,AMPK,LC3A/B及ULK1的表达,下调自噬相关蛋白mTOR及p-ULK的表达,导致细胞发生自噬性死亡,而肝豆汤可通过调控LKB1/AMPK信号通路,下调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,LC3A/B,ULK及AMPK的表达,上调自噬相关蛋白及基因mTOR及p-ULK的表达,抑制自噬的发生,阻断高铜诱导的神经元损伤,从而发挥神经保护作用。     

基于Gln/GLS1/α-KG代谢轴和线粒体凋亡信号通路探讨木瓜总三萜抗D-半乳糖诱导GES-1细胞衰老的作用机制

木瓜总三萜(total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa, TCS)是防治胃黏膜损伤的活性组分,具有潜在的抗衰老作用。然而,TCS是否改善胃衰老,尤其是对于其抗胃衰老的分子机制目前仍不清楚。基于此,该研究旨在探讨TCS对D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1衰老的影响及作用机制,为TCS在临床上用于预防胃衰老提供科学数据。将体外培养的GES-1细胞和转染谷氨酰胺酶1(glutaminase 1, GLS1)过表达(overexpression GLS1, GLS1-OE)质粒的GES-1细胞用D-gal诱导衰老后,给予TCS和谷氨酰胺酶1(glutaminase 1, GLS1)抑制剂bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl) ethyl sulfide(BPTES),考察各组细胞存活率、衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, SA-β-gal)染色阳性细胞比例、线粒体膜电位(mitochondria...     

表木栓醇对紫外线致人真皮成纤维细胞光老化的保护作用

目的探讨黑榆根皮有效成分表木栓醇抑制UVB照射引起的皮肤老化作用及机制。方法在37°C、5%CO_2、95%空气饱和湿度的培养箱内体外培养原代人真皮成纤维细胞,将细胞分为5组:即正常对照组、UVB照射模型组、表木栓醇30μg·ml~(-1)组、表木栓醇50μg·ml~(-1)组、表木栓醇100μg·ml~(-1)组,研究表木栓醇对模型照射引起人真皮成纤维细胞老化的作用以及对老化调控蛋白p53表达的影响。在裸鼠背部皮肤上分成了4组,即正常对照组、模型组、表木栓醇20μg·g-1组、表木栓醇50μg·g-1组,研究表木栓醇在体内真皮层的药效作用。结果细胞实验显示,表木栓醇浓度依赖性地抑制UVB照射引起的人真皮成纤维细胞的老化,浓度依赖性地抑制老化调控蛋白p53的表达。模型组与正常对照组比较,SA-β-gal染色率显著升高,p53表达显著升高,表木栓醇50,100μg·ml~(-1)组与模型组比较,SA-β-gal染色率都显著降低(P0.05,P0.01),p53表达也都显著降低。动物实验显示,模型组与正常对照组比较,真皮层SA-β-gal染色明显增强,表木栓醇50μg·g-1组与模型组比较,真皮层SA-β-gal染色明显减弱。结论黑榆根皮成分表木栓醇通过调控p53的表达抑制UVB照射引起的皮肤老化。     

基于microRNA-34a/SIRT1/p53通路探讨三七皂苷R_1对血管内皮细胞衰老的影响

该研究旨在探讨三七皂苷R_1能否通过调控miRNA-34a/SIRT1/p53通路发挥延缓H_2O_2诱导的血管内皮细胞衰老的作用。以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为研究对象,建立H_2O_2诱导的衰老模型,以白藜芦醇作为阳性对照药,实验分为青年组、H_2O_2模型组、三七皂苷R1组、白藜芦醇组。药物组提前加入三七皂苷R1(30μmo L·L~(-1))或白藜芦醇(10μmo L·L~(-1))干预24 h,然后用H_2O_2(100μmo L·L~(-1))造模4 h,最后换成完全培养基培养24 h。采用衰老特异性β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法鉴定细胞衰老程度,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,WST-1法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力,QRT-PCR检测miRNA-34a,SIRT1和p53的核酸表达,Western-blot技术检测SIRT1,p53和衰老相关蛋白p21,p16的蛋白表达。结果发现,与模型组相比,三七皂苷R1组和白藜芦醇组可有效减低衰老内皮细胞的β-半乳糖苷酶染色阳性率,增强细胞增殖能力和SOD活力,减少G0/G1期细胞比例,增加S期细胞比例,抑制了miRNA-34a和p53的核酸表达,促进了SIRT1的核酸表达,此外抑制了p53,p21和p16的蛋白表达,促进了SIRT1的蛋白表达,差异均有统计意义(P0.05)。该研究表明,H_2O_2诱导的衰老的内皮细胞可以作为衰老研究的模型,三七皂苷R1延缓血管内皮细胞衰老的效果明显,其机制可能是通过调控miRNA-34a/SIRT1/p53通路延缓了血管内皮细胞衰老的进程。     

大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制

目的:探讨大黄酸抑制饥饿诱导的肾小管上皮(NRK-52E)细胞自噬蛋白的作用和分子机制。方法:用Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)诱导NRK-52E细胞产生饥饿状态,在干预后的各时间点(0,0.5,1,2,6 h),首先,检测细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)I/II的表达水平;其次,检测细胞哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)表达及其磷酸化水平(phosphorylated-m TOR Ser2448,p-m TOR S2448);然后,以大黄酸(5 mg·L-1)、HBSS(1 m L)以及m TOR抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L-1)单独或联合干预,分别检测其LC3 I/II,m TOR,p-m TOR S2448蛋白表达水平的变化。结果:HBSS诱导NRK-52E细胞LC3II蛋白高表达、p-m TOR S2448蛋白低表达;大黄酸与HBSS联合干预可以逆转HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II和p-m TOR S2448蛋白表达水平;雷帕霉素与大黄酸、HBSS联合干预可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II蛋白表达水平。结论:HBSS抑制m TOR信号通路活性而诱导肾小管上皮细胞发生自噬;大黄酸调控m TOR信号通路活性而抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白的表达,这可能就是其干预细胞自噬的作用和分子机制。     

二苯乙烯苷对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞衰老的保护作用

目的探讨二苯乙烯苷对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞衰老的保护作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞后,AngⅡ诱导细胞衰老模型,MTS法检测细胞存活率,SA-β-gal染色分析细胞衰老程度,qPCR检测miR-34a mRNA表达,Western blot检测p53、PAI-1、SIRT1、E2F1蛋白表达。结果二苯乙烯苷干预后,细胞存活率、SIRT1蛋白表达显著升高(P0.05),β-gal阳性率及p53、PAI-1蛋白表达显著降低(P0.05)。同时,该成分对miR-34a、E2F1表达也有明显抑制作用(P0.05)。结论二苯乙烯苷对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞衰老具有明显保护作用,其作用机制可能与抑制miR-34a、E2F1表达及促进SIRT1蛋白表达有关。     

电针通过调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对衰老小鼠肝脏自噬与氧化应激的影响

目的:观察电针对衰老小鼠体力及肝脏AMP活化的蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、Atg5、Atg7、Atg13和Beclin1表达的影响,探索其通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路延缓衰老的机制.方法:将30周龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、雷帕...     

抑制AMPK观察清燥救肺汤对肺癌细胞自噬启动相关蛋白表达的影响

目的 观察应用腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制剂（compound C）后，清燥救肺汤对肺癌细胞自噬启动相关蛋白AMPK，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），UNC-51样激酶1（ULK1）表达的影响。方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为模型组，环磷酰胺（CTX）组（50 mg·kg^-1），清燥救肺汤组（11 g·kg^-1），AMPK抑制剂组（10 mg·kg^-1），清燥救肺汤加AMPK抑制剂组（清燥加抑制剂组）（11 g·kg^-1+10 mg·kg^-1）。小鼠右腋皮下注射Lewis肺癌细胞构建肺癌荷瘤模型。造模24 h后，CTX组腹腔注射给药，隔日1次，共7次，AMPK抑制剂组与清燥加抑制剂组腹腔注射compound C，每日1次，共14 d。清燥救肺汤组和清燥加抑制剂组，造模前后14 d均以中药设定剂量灌胃给药。实验结束后处死各组小鼠并取荷瘤组织，统计各组瘤质量；透射电镜（TEM）观察各组肺癌组织自噬溶酶体的生成情况；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测AMPK，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK），mTOR，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR），ULK1，磷酸化UNC-51样激酶1（p-ULK1），微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）和p62蛋白的表达；苏木素-伊红（HE）染色观察各组肺癌组织病理学变化。结果 与模型组比较，清燥救肺汤组瘤质量降低（P<0.01），电镜下发现自噬溶酶体生成，p-AMPK，p-ULK1，LC3B，LC3B-Ⅱ蛋白表达和p-AMPK/AMPK，p-ULK1/ULK1，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均升高（P<0.05，P<0.01），p-mTOR，p62蛋白表达和p-mTOR/mTOR均降低（P<0.05）。与清燥救肺汤组比较，清燥加抑制剂组电镜下未见自噬溶酶体生成，p-AMPK，p-ULK1，LC3B，LC3B-Ⅱ蛋白表达和p-AMPK/AMPK，p-ULK1/ULK1，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均明显降低（P<0.05，P<0.01），p62蛋白表达升高（P<0.05）。HE染色结果显示，各给药组肺癌组织与模型组比较，病理有明显改善。结论 清燥救肺汤能促进自噬发生标志蛋白LC3B-Ⅱ升高及p62蛋白表达降低从而诱导自噬发生，其自噬启动机制可能不是调控AMPK/mTOR/ULK1通路介导，而是通过AMPK/ULK1通路实现的。     

丹酚酸B对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制研究

观察丹参的主要成分丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响,探讨其防治糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的可能机制。采用体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞,随机分为对照组(NG)、高糖组(HG)、高糖+10μmol·L~(-1) Sal B组(Sal B),上述3组分别设6,12,24,48 h 4个时间点进行动态观察;高糖+Sal B不同浓度(1,5,10μmol·L~(-1))组、高糖+5.0μmol·L~(-1)吡格列酮对照组(pioglitazone,PIO)、高糖+10μmol·L~(-1) Sal B+5.0μmol·L~(-1) GW9662对照组(Sal B+GW9662)。采用Western blot法检测PPARγ,PTEN,α-SMA,E-cadherin的表达变化以及PI3K/Akt通路的变化;Real-time PCR法检测PPARγ,PTEN mRNA的表达水平。结果显示,与NG组相比,HG组PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平均逐渐降低,α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin蛋白表达水平逐渐降低,呈时间依赖性;与HG组相比,高糖+Sal B不同浓度组随Sal B剂量增加,PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平逐渐降低,E-cadherin蛋白表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性(P0.05),但1μmol·L~(-1)浓度的Sal B对PPARγ mRNA和蛋白、PTEN mRNA表达的影响没有显著性差异;与HG组相比,Sal B动态观察组PPARγ mRNA(除6 h)和蛋白(除6 h),PTEN mRNA(除6 h)和蛋白(除6,12 h)表达水平明显增高,α-SMA,p-Akt~((Thr308))(除6 h)蛋白表达水平明显降低,E-cadherin蛋白表达水平明显增高(P0.05);与HG组相比,Sal B和PIO显著增强PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平,增高E-cadherin蛋白表达水平,降低α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平(P0.05),各用药组之间差异无统计学意义;而Sal B+GW9662对照组PPARγ和PTEN的mRNA和蛋白,E-cadherin、α-SMA和p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平与高糖组比较没有统计学意义,Sal B的作用效应被PPARγ拮抗剂GW9662阻断。结果表明,丹酚酸B可抑制高糖诱导的NRK-52E细胞发生EMT,其机制可能为Sal B通过激活PPARγ的活性,上调PTEN表达,进而抑制PI3K/Akt信号通路的致纤维化效应有关。     

曲尼司特对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞E-cadherin表达的影响

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的NRK-52E细胞转分化过程中转分化标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达情况及曲尼司特对其转分化过程的影响。方法应用TGF-β1(8 mg/L)刺激NRK-52E细胞,分别分为阴性对照组、TGF-β1诱导组和不同剂量曲尼司特干预组,采用流式细胞术和蛋白质印迹检测各组E-cadherin的表达情况。结果流式细胞术和蛋白质印迹检测结果表明,TGF-β1刺激后,NRK-52E细胞E-cadherin的表达均显著减低。结论曲尼司特能够抑制TGF-β1诱导的NRK-52E转分化,其机制可能与上调E-cadherin的表达有关。     

曲尼司特对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞表达α-SMA的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的NRK-52E转分化过程中转分化标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况及曲尼司特对其的影响。方法 NRK-52E经培养传代后随机分为阴性对照组,TGF-α1诱导组和不同剂量曲尼司特干预组,采用流式细胞仪测定α-SMA(+)细胞的百分数,Western-blot分析细胞表达α-SMA的程度。结果流式细胞术分析显示阴性对照组α-SMA阳性细胞百分比明显增多,说明细胞发生EMT;曲尼司特干预组细胞表达α-SMA阳性细胞百分比呈剂量依赖性递减,且与阳性对照组比较有显著性差异(P<0.05);Western-blot结果也表明,曲尼司特能剂量依赖性降低NRK-52E胞质α-SMA表达的程度。结论曲尼司特可以抑制肾小管上皮细胞α-SMA的表达,从而抑制EMT,减少ECM的积聚,保护肾脏。     

真武汤对NRK-52E细胞“AVP-V2R-AQP2”通路的调控作用研究

该实验探讨真武汤对体外培养NRK-52E细胞AQP2相关的"AVP-V2R-AQP2"通路的调控作用,初步揭示真武汤调节水分转运平衡的部分分子机制。取SPF级雄性SD大鼠48只,随机分成8组,每组6只。分别给予蒸馏水或真武汤22.68 g·kg~(-1)·d~(-1)(按生药量计)灌胃,心脏采血,3 000 r·min~(-1)离心分离制备含药血清。然后体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞,给予上述不同给药天数和日给药次数制备的真武汤含药血清和血管加压素类似物1-去氨基-8-右旋-精氨酸加压素(1-desamino-8-D-arginine vasopressin,d DAVP)进行干预,采用实时无标记动态细胞分析技术(Real time cell analysis,RTCA)检测细胞增殖情况;免疫荧光法检测细胞中V2R,AQP2蛋白的分布情况;Western blot法检测V2R,PKA,AQP2的蛋白表达量;Real-time PCR法检测AQP2 mRNA水平。结果显示,与正常大鼠血清组比较,每天给药2次连续给药7 d制备的真武汤含药血清作用于NRK-52E细胞约24 h,可显著上调其AQP2的mRNA水平(P0.01);显著增加V2R,PKA,AQP2的蛋白表达量(P0.05,P0.01,P0.05);该方法制备的真武汤含药血清与d DAVP合用干预NRK-52E细胞后,可显著增加V2R,p-AQP2和AQP2的蛋白表达量(P0.01,P0.05,P0.01)。以上实验结果表明,真武汤含药血清能增加NRK-52E细胞"AVP-V2R-AQP2"通路中V2R,PKA及AQP2的蛋白表达量,与d DAVP合用存在协同效应,提示"AVP-V2R-AQP2"通路可能是真武汤调节水分转运平衡的分子机制之一。