人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 探讨人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定,以备后续对其生物学特性研究之用.方法 取2006年～2007年行鼻窦内窥镜下摘除的鼻息肉及行鼻中隔手术切除的正常下鼻甲各 5 例.标本放入4℃无菌的 PBS(配有双抗)溶液中,在超净台中反复冲洗、浸泡,剪成米粒大后转入培养瓶中,用0.1%胶原酶Ⅳ消化过夜.次日取出,轻轻吹打,加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12(1:1)培养液,置 37℃饱和湿度 CO2细胞培养箱中培养.采用ABC 贴壁法去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞.倒置相差显微镜下观察细胞形态、增殖及生长状况、有无污染.流式细胞仪检测细胞纯度.结果 鼻黏膜上皮细胞生长良好,可见 4 种细胞:纤毛柱状上皮细胞、无纤毛柱状上皮细胞、杯状细胞、基底细胞.透射电镜下鼻息肉黏膜上皮细胞膜表面纤毛较正常鼻黏膜上皮细胞的纤毛数减少,纤毛倒伏,胞质内有空泡形成.经流式细胞仪检测鉴定上皮细胞占 90.1%.结论 此方法培养的鼻黏膜上皮细胞纯度高,是一种较好的获得原代鼻黏膜上皮细胞的方法.     

人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

目的：研究人龈上皮细胞体外原代和传代培养，建立能够体外长期培养的人龈上皮细胞系。方法：取健康龈组织块，经0．25％分离酶作用后．将上皮组织与其下的结缔组织分离，0.125％胰酶消化上皮组织形成细胞悬液，接种培养。当细胞汇合达80％时，1：2传代培养。结果：获得的原代培养细胞表达细胞角蛋白，结合细胞形态。可初步认定为龈上皮细胞。原代培养的人龈上皮细胞部分可以传代培养到第3代。结论：建立能够长期体外培养的龈上皮细胞系具一定可行性。     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

大鼠宫颈上皮细胞的原代培养

目的探索大鼠宫颈上皮细胞的培养方法。方法分离大鼠宫颈上皮细胞,采用上皮细胞培养无血清培养基,添加牛脑提取物和表皮生长因子(EGF)进行培养。结果大鼠宫颈上皮细胞培养8 d后,可以在显微镜下观察到宫颈上皮细胞从组织碎片中移出,大片贴在培养瓶壁上,成集落状生长。结论使用上皮细胞无血清培养基添加EGF、牛脑提取物可以实现大鼠宫颈上皮细胞的原代培养。     

哈萨克族食管正常上皮细胞的原代培养方法

目的：培养哈萨克族（哈族）成人食管正常上皮细胞,建立能够在体外长期培养的哈族食管上皮细胞系,为上皮细胞的体外研究提供实验材料。方法取哈萨克族食管癌患者正常食管上皮,用0．25％中性蛋白酶（DispaseⅡ）和0．05％胰蛋白酶/0．03％ EDTA 联合消化获取哈族食管上皮细胞,使用 EpiCM-2无血清培养基培养,通过细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定培养的食管正常上皮细胞的来源。结果首次培养的原代哈萨克族正常食管上皮细胞经8～10 d 后可融合成片,融合率为80％～90％,细胞呈“铺路石”样生长,细胞角蛋白表达阳性,可连续传代,传代的细胞经3～5 d 可达到80％～90％融合。结论建立的体外分离培养哈族成人食管正常上皮细胞的方法方便可行。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

小肠粘膜上皮细胞原代培养最适条件的研究

本文定量研究了小肠粘膜上皮细胞原代培养方法的最适条件。Ｗｉｓｔａｒ系胎鼠小肠备成小肠绒毛细胞团悬液。接种于处理后的２４孔培养板，采用ＭＴＴ显色法定量研究影响小肠上皮细胞贴壁生长的各种因素。结果显示培养液质量、培养时间、ＣＯ２浓度、肠绒毛细胞团接种浓度、胎牛血清浓度和加药时间是影响肠上皮细胞贴壁生长的主要因素，并得到了上述因素的最适培养条件。上述研究结果可为体外探讨细胞生长因子和肠营养素对肠上皮细胞结构、功能、生长和分化的影响提供了一种可靠、定量的研究手段。     

大鼠泪腺上皮细胞的原代培养和鉴定

目的 从大鼠泪腺组织分离泪腺上皮细胞并鉴定。方法 采用胶原酶Ⅰ、透明质酸酶和DNA酶混合消化法分离细胞,并对泪腺上皮细胞进行纯化和鉴定。采用胶原预包被培养瓶,并在培养基中添加霍乱毒素(cholera toxin, CT)维持上皮细胞形态。采用细胞免疫荧光染色方法对培养的泪腺细胞主要标志物进行鉴定,包括上皮细胞标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-Cad),间充质细胞标志蛋白波形蛋白(vimentin, Vim),肌上皮细胞标志蛋白α-SMA和S100蛋白。结果 原代培养的泪腺上皮细胞在3天内贴附到瓶底上,并增殖形成汇合的单层细胞。泪腺上皮细胞表现出鹅卵石形态,并混有少量梭形细胞。分离培养的细胞高表达CK和E-Cad,弱表达α-SMA和S100蛋白,基本不表达Vim。结论 本研究成功建立了大鼠泪腺上皮细胞的原代培养方法,为泪腺疾病尤其是干眼病和干燥综合征的研究提供了一种稳定经济的体外模型。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的 :探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法 :采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞 ,将其种植在PLGA膜上 ,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果 :采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层 ,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞 ,将其植入PLAG膜上 ,细胞获得很快生长 ,5d时细胞出现分化 ,8d时可以长到 5层左右。结论 :本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞 ,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

温肾中药对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响

目的观察温肾中药对雌二醇和孕酮所致的原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响。方法采用消化法进行正常人乳腺上皮细胞分离及原代培养。在相差倒置显微镜和透射电镜下对细胞进行形态学鉴定。应用雌二醇和孕酮干预以促使正常人乳腺上皮细胞增殖,给予不同浓度温肾中药及他莫昔芬进行药物干预。采用MTT法检测不同浓度、不同药物干预下乳腺上皮细胞的增殖情况。结果原代培养正常人乳腺上皮细胞经形态学鉴定符合正常人乳腺上皮细胞的形态学特征。浓度均为1×10-5g/L的雌二醇和孕酮混合培养液可以明显促进正常人乳腺上皮细胞增殖。高浓度温肾中药能明显促进原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖,而低浓度温肾中药则可抑制其增殖。他莫昔芬对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖无明显影响。结论雌二醇和孕酮可以促进正常人乳腺上皮细胞增殖。温肾中药调节正常人乳腺上皮细胞增殖的作用与药物浓度相关。     

人类晶体上皮细胞的体外培养与观察

目的：建立人类晶体上皮细胞培养的简便方法并观察原代和传代细胞的生物学特征和组织学变化。方法：将人工晶体植入术中取下的前囊膜分割成小碎片，吸管转移至培养瓶底部进行原代培养，7—10d后常规方法进行传代培养，采用相差显微镜观察活体细胞的增殖活动和形态学变化。结果：人类晶体上皮细胞在体外培养时可以存活并传代，但是其生存能力与供体年龄有关。传代后期细胞发生纤维化改变。结论：本方法简便，有效。可用于实验研究。     

人尿路变移上皮种子细胞的体外培养与鉴定

目的对人尿路变移上皮细胞进行原代和传代培养,探讨并建立细胞的培养体系,用于泌尿系统组织工程种子细胞的相关研究。方法采集人。肾脏手术标本的。肾盂、输尿管正常上皮组织利用组织块法,使用添加附加表皮生长因子（EGF）及牛垂体提取物（BPE）成分的角朊细胞无血清培养液（KSFM）进行细胞原代培养,用含EGF及BPE的KSFM进行传代培养。观察培养细胞的形态和增殖情况,经HE染色和免疫细胞化学sP法染色进行鉴定。结果培养制备的人尿路上皮细胞呈现典型的变移上皮细胞形态特征,原代培养9—12d时细胞汇合可达80％。免疫细胞化学染色显示细胞角蛋白（CKAE1/AE3）阳性。分离培养的为单一的人尿路变移上皮细胞,无成纤维细胞混杂。结论采用组织块法分离培养的人尿路变移上皮细胞在添加EGF及BPE的KSFM培养液中可维持良好的生物学特性,并具有一定的增殖传代能力。该培养体系所获得的细胞可用于人泌尿系统的基础研究及组织工程的进一步研究。     

人无排卵功血子宫内膜上皮细胞生物学特性初步研究

目的 探讨ADUB EEC的部分生物学特性.方法 采用电镜、MTT、磁酶免及免疫组化等方法了解ADUB EEC的超微结构、生长曲线、CA125分泌及PCNA、ER、PR表达情况,并与在体ADUB子宫内膜组织及培养的正常EEC进行比较.结果 体外培养的ADUB EEC基本保留了体内的结构特征,体外增生水平低,分泌异常.结论 原代培养的ADUB EEC为研究无排卵功血发病机制及治疗奠定了实验基础.     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法.方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代.在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色.结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞.结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长.     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及生物学特性

目的探讨适用于小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)分离培养及鉴定的技术方法。方法采用机械研磨肾脏组织分离肾小管节段并结合Ⅱ型胶原酶消化分离培养法进行mRTECs原代培养,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;锥虫蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法、DNA周期检测法分别测定和观察mRTECs传代成活率、生长情况及增殖特征;免疫荧光染色法鉴定细胞。结果获得的细胞3 d后从贴壁的肾小管节段边缘长出,7 d后呈铺路石样,生长迅速可传代;传代细胞成活率达96%以上;第1代(P1)、第3代(P3)细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示P1、P3细胞生长至第3～5天光密度值变化较明显;随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,光密度值无明显变化,细胞逐渐衰老;P1细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为78.9%和21.1%,P3细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为82.1%和17.9%;P3细胞行免疫荧光染色细胞角质蛋白-18及上皮型钙黏素显示细胞质内蛋白表达阳性,细胞阳性率均达98%。结论机械研磨并结合Ⅱ型胶原酶消化培养法能成功培养mRTECs,建立稳定、高效的细胞分离和培养技术方法,为肾脏疾病与心血管功能相关性研究提供理想的细胞来源。     

人子宫内膜腺上皮细胞原代培养方法的改进

目的改进子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法,以使其可作为功能失调性子宫出血(功血,Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB)的体外实验模型之一.方法在取材、培养条件和细胞纯化等方面对子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法作了改进.结果34份标本,23份获得成功.培养时间为4～22d,无1例发生污染.接种后的5～6d为进行实验的最佳时间.结论改进后的子宫内膜腺上皮细胞原代培养法克服了污染问题,增加了可获得的细胞数.子宫内膜腺上皮细胞的分离、培养可作为功血的体外实验模型之一.