中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

基于COI 条形码的鹿类中药材DNA 条形码分子鉴定

目的：利用COI 序列建立统一的鹿类药材分子鉴定方法。方法：对鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分别进行DNA 提取、COI 序列扩增和序列测定,构建鹿类药材COI 序列数据库,并对市售鹿类药材进行调查分析。结果：所有鹿类药材均可以使用COI 通用引物进行PCR 扩增和测序;鹿类药材COI 序列数据库包含8 个物种101 份样品,物种之间相互区分明显;市售40 份药材中18 种为药典规定物种,22种为非药典规定物种。结论：COI 序列的DNA 条形码分子鉴定方法可以作为鹿类药材的统一鉴定方法,并为市售鹿类药材的鉴定提供科学依据。     

基于DNA条形码鉴定豆蔻类中药材

目的：利用ITS2序列对豆蔻类中药材进行DNA条形码鉴定研究。方法：本文采集了包括豆蔻两个基原白豆蔻Amomum kravanh与爪哇白豆蔻Amomum compactum、红豆蔻Alpinia galanga、草豆蔻Alpinia katsumadai等在内的70份样品,采用试剂盒法提取基因组DNA,应用Primer premier 5.0设计引物,通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增其ITS2序列,并对PCR产物进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner V3.71拼接后,采用MEGA5.0 软件进行序列比对,计算种内和种间距离,构建邻接树（Neighbor-joining tree,NJ Tree）。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov model,HMM）的注释方法获得。结果：通过新设计引物扩增的序列可以注释到5.8 S与28 S,扩增序列位于ITS2间隔区。采用新设计的引物,所有实验样品均可获得ITS2序列,NJ树结果显示不同种豆蔻类药材分别聚为一支,可以互相区分,且可以与其混伪品相互区分。另外,通过序列比对发现有5个SNP（s）存在于豆蔻与其它物种种间,且有2个稳定的SNP（s）存在于白豆蔻和爪哇白豆蔻种间,可用于二者的准确鉴定。结论：ITS2序列作为DNA条形码可准确稳定地鉴别不同种豆蔻类药材,本研究将为保障临床安全用药提供新的技术手段。     

海马、海龙基于COI条形码的DNA分子鉴定

目的:利用COI序列对海马、海龙及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对海马、海龙及其混伪品共14个种20份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材的正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:海马、海龙种内COI序列变异很小比较稳定.海马、海龙及其混伪品种间COI序列变异较大,存在较多的变异位点,分析结果表明种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离,这与形态学分类的结论相一致.由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的枝,其支持率均为100,海马、海龙COI序列可以明确的与混伪品COI序列区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定海马、海龙的基源动物及其混伪品,本研究为海马、海龙的鉴别提供了新的可行性方法,在其他动物药品种鉴定中也具有较大的应用价值.     

基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究

目的：基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行TaqMan探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法。方法：本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定。结果：在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,TaqMan探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出。结论：基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异TaqMan探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考。     

中药材DNA条形码鉴定研究进展

DNA条形码技术给中药鉴定学发展带来新的机遇,中药材DNA条形码鉴定数据库及中草药DNA条形码生物鉴定体系的创建有利于推进中药鉴定标准化和国际化。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中华人民共和国药典》2010版第三增补本,为中药材基原物种鉴定提供强有力的科技支撑,将在中药材及中成药流通监管、道地药材鉴别、保健食品和食品质量安全控制等领域发挥重要作用。将中药材DNA条形码分子鉴定法与中国药典规定的其他鉴别方法相结合,能够对药品质量进行综合评价与有效监控。     

溪黄草DNA 条形码鉴定研究

目的：研究DNA条形码技术在溪黄草药材品种鉴定中的适用性。方法：选取rbcL、psbA -trnH、matK 和ITS2 等4 个条形码标记,对41 份溪黄草药材样品（含溪黄草Rabdosia serra、线纹香茶菜R. lo原phanthoides 和纤花香茶菜R. ophanthoides var. graciliflora）进行DNA 提取、PCR 扩增及双向测序,对测序结果进行质量检查、人工校对和序列拼接获取标准碱基序列信息,通过比较序列获得成功率以及物种鉴定力（TaxonGap 法）,筛选适合溪黄草基原鉴定的DNA 条形码序列。结果：条形码序列获得成功率依次为rbcL（100%）、psbA -trnH（90.2%）、ITS2（87.8%）和matK（70.7%）;物种鉴定力方面,rbcL、psbA -trnH 和ITS2 等3条序列均可有效鉴定不同物种,但不适于分辨种下单位。结论：综合考察序列易得性和物种鉴定力,rbcL可作为溪黄草品种鉴定的首选条形码。     

中华蟾蜍DNA条形码鉴定

目的:通过DNA条形码研究鉴别中药材中华蟾蜍Bufo gargarizans Cantor及其混伪品的可行性。方法:从Gen Bank下载了6种蟾蜍属Bufo、2种林蛙属Rana、1种侧褶蛙属Pelophylax和1种小鲵属Hynobius的COI线粒体基因DNA序列。用Clustal X 1.81和Bio Edit软件分别对序列进行比对和编辑。利用MEGA 4.0软件按照Kimura双参数法计算种内和种间的遗传距离。用贝叶斯法和简约法构建系统发育树对中华蟾蜍进行鉴定。结果:构建的系统发育树表明,中华蟾蜍的所有样本聚类为一个单系,能很好地与其他混伪品区分。结论:COI条形码DNA序列能够对中药中华蟾蜍进行准确鉴定。     

基于DNA条形码的藤类药材鉴定

目的:对《中国药典》中记载的14种藤类药材进行分子鉴定。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:14种藤类药材的ITS2序列长度为190-284 bp;各药材种内K2P遗传距离为0-0.053,远远小于种间K2P遗传距离(平均值为0.852,最小值为0.309);由所构建的系统聚类树图可以看出,本研究中具有不同产地来源样品的药材均表现出了单系性,同时又与其它药材明显分开。结论:ITS2序列作为条形码适用于鉴定《中国药典》中藤类药材,在中药材的鉴定领域具有重要的应用前景。     

冬虫夏草及虫草类产品DNA条形码鉴定研究

冬虫夏草为我国名贵中药材,替代、掺伪、造假等现象普遍,为实现其准确鉴别,该研究采用DNA barcoding方法对6种116份虫草菌和146份寄主分别进行鉴定,并收集了6种29份虫草类产品,基于ITS序列设计虫草菌特异引物,结合虫体COⅠ序列鉴定,对冬虫夏草及其类似产品进行更精确的鉴定。结果表明,基于ITS序列和COⅠ序列均可实现冬虫夏草与虫草类物种及伪品的鉴别;通过2对ITS特异引物ITSSF1/ITSSR1和ITSSF2/ITSSR2,可分别特异扩增到297 bp和136 bp的冬虫夏草菌短片段,实现了冬虫夏草菌与易混淆物种的快速鉴别;而结合COⅠ序列可应用于粉末状态下冬虫夏草全草与人工培育菌丝的准确区分,并实现虫草类产品的快速检测。因此,ITS特异引物结合COⅠ序列,冬虫夏草与发酵菌丝及虫草类产品可快速、准确鉴别。     

药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析

DNA条形码（DNA barcoding）是近年来生物分类和鉴定的研究热点和方向,其在药用植物鉴定中的成功应用将可能是生药鉴定方法的革命性突破。本文结合具体研究工作就构建药用植物DNA条形码鉴定平台的标准化流程、药用植物DNA条形码鉴定序列的选择、DNA条形码序列校对机制、DNA条形码序列鉴定效率评价方法进行了探讨,并展望了DNA条形码的发展趋势。     

中药DNA条形码鉴定体系及研究方向

近年来,中药DNA条形码分子鉴定得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。通过中药DNA条形码鉴定研究,我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列,并建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI序列为核心、ITS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定体系,为中药DNA条形码鉴定的发展奠定了坚实基础。本文结合课题组研究工作就构建中药DNA条形码鉴定体系进行了综述,包括中药DNA条形码序列的筛选确定、中药DNA条形码鉴定流程和中药DNA条形码鉴定数据库系统构建,并介绍了中药DNA条形码鉴定的研究方向。     

中草药DNA条形码生物鉴定体系

中药材品种混乱及真伪鉴定方法欠缺严重影响中医药的疗效与安全,陈士林课题组创建了崭新的“中草药DNA条形码生物鉴定体系”,为中药鉴定学开辟了新的方法学领域,从基因层面解决了中药材与混伪品的物种识别问题。     

化橘红药材质量评价、监测与应用研究

目的：评价化橘红质量,确定质量监测方法。方法：以形态分类法和显微鉴定法比较原植物及显微构造,以分光光度法比较总黄酮含量,以高效液相色谱法比较柚皮苷含量及指纹图谱,以薄层扫描法比较野漆树苷含量。结果：两类化橘红原植物存在外果皮绒毛、茎非腺毛等显著差异;化橘红总黄酮含量、柚皮苷含量均高于光橘红,野漆树苷含量为光橘红的10倍,指纹图谱也有显著差异。化州柚鲜果重量增加峰值出现在成果41d时,此时其药材质量也较优。结论：道地药材化橘红质量显著优于光橘红,化橘红采收期宜定在41d左右。     

濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定

兰科药用植物形态分类困难,此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK,psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定,经DNA提取,PCR扩增、双向测序及校对拼接后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining(NJ)法构建物种系统进化树。结果表明,163份样品均能成功提取DNA;matK,psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%,100%,98.77%;共获得487条序列,其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列,142条为新增序列;运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中,基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK,psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充,DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

DNA条形码鉴定药用植物的研究进展

DNA条形码是利用基因组中标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术,已成为生物分类和鉴定的研究热点。近年来,DNA条形码技术鉴定药用植物的研究发展迅速并日趋成熟。文章简述了DNA条形码技术鉴定药用植物的原理并重点介绍了DNA条形码鉴定药用植物的应用,展望其在今后广泛应用于药用植物的鉴定。     

全蝎DNA条形码分子鉴定研究

目的:本研究通过COI序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别,为全蝎药材分子鉴定提供科学依据。方法:通过野外采集东亚钳蝎正品,对采集样品形态学鉴定、DNA提取、PCR扩增COI序列,测序建立东亚钳蝎的正品COI数据库,通过比对确定东亚钳蝎正品和伪品的DNA条形码。结果:实验共获取310份东亚钳蝎样本。通过序列分析,确定东亚钳蝎COI序列长度为658 bp。采用MEGA 6.0软件对东亚钳蝎样品及混伪品进行序列比对,构建邻接(NJ)树。结果表明东亚钳蝎COI序列扩增成功,与混伪品COI序列明显区分。结论:本研究运用COI条形码序列可准确鉴定全蝎的基原动物及其混伪品,为后续全蝎药材的分子鉴定提供了新的可行性方法。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

荚蒾属植物DNA条形码鉴定

目的:通过分析13种荚蒾属药用植物的ITS2(internal transcribed spacer 2)条形码序列,探讨荚蒾属植物属内鉴定的新方法,为荚蒾属植物的快速、准确、批量鉴定提供方法学依据。方法:该研究收集13种荚蒾属植物共32份样品,进行基因组DNA提取、PCR扩增ITS2序列并测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接并剪切后,采用MEGA5.1软件计算遗传距离,比较种内、种间序列差异,利用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统聚类树。结果:基于ITS2序列分析,13种药材种间存在明显差异,各个种的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离;构建的系统树各个种不同样本均分别聚在一起,表现出单系性。结论:ITS2序列作为DNA条形码可较好地用于荚蒾属植物的鉴定研究,有助于为荚蒾属植物鉴定提供分子生物学方法基础,也为日后荚蒾属植物的开发打下坚实基础。