脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

诱导脂肪干细胞成内皮分化的研究进展

<正>慢性难愈创面影响着全球数百万危及生命的个体,可能导致截肢和严重的疾病^[1]。微血管病变所致的局部组织缺血微循环障碍是创面难愈的主要原因之一^[2]。国内外学者应用内皮细胞治疗缺血性疾病已取得一定的疗效,但由于内皮细胞难以获取且为终末细胞,无法在体外大量扩增而受到限制^[3]。近年来,血管组织工程的发展为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。     

脂肪干细胞成骨分化的研究进展

随着骨组织工程研究取得较好的发展,涌现出各类种子细胞。脂肪干细胞,来自脂肪组织,具有诸多的优势,成为骨组织工程研究的热点种子细胞之一。本文综述了脂肪干细胞成骨分化的诱导方法、过程、验证方法、影响成骨分化的供体因素和实验因素,并对其未来研究方向进行了展望。     

软骨组织工程中脂肪来源的多能干细胞的研究进展

骨软骨组织工程需要来源广泛、采集容易、痛苦小、分化潜能大的种子细胞。脂肪来源干细胞具有比骨髓间质干细胞更多的优点,成为种子细胞的热选之一。本文将对脂肪干细胞在成软骨方面的研究进行评述,供同行参考、借鉴。     

脂肪干细胞联合富血小板血浆修复关节软骨研究进展

关节软骨容易受到损伤,而且缺乏自我修复的能力,传统治疗方法效果并不理想。随着再生医学和组织工程学的发展,越来越多的研究表明,自体脂肪干细胞联合富血小板血浆(PRP)修复关节软骨疗效显著。干细胞是尚未分化的原始细胞,在一定条件下可以向骨、软骨和脂肪等细胞分化;PRP是高度浓缩的血小板提取物,含有多种细胞生长因子。将干细胞与PRP联合应用,双重强化了关节软骨的修复作用,且来源自体,安全可靠。     

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的 通过观察不同浓度外源性一氧化氮（nitric oxide ,NO）供体硝普钠（SNP）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法 获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L、4.00 mmol/L）下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR（RT-PCR）方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1（TGF-β1）以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、 Ⅱ胶原蛋白（Col-Ⅱα1）基因的变化。结果 培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高（P<0.05）;与对照组相比,低浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L）对ADSCs的增殖无明显影响（P>0.05）,高浓度SNP（4.00 mmol/L）抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1 mRNA的表达,同时抑制Smad3 mRNA和Col-Ⅱα1 mRNA的表达。结论 在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。     

中药诱导干细胞软骨分化的实验研究进展

关节软骨退变和其继发的骨质增生是骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的核心病理改变。在机械性和生物性因素作用下,关节软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨正常合成和降解偶联失衡,关节软骨纤维化、溃疡、缺失,软骨下骨的硬化,骨赘形成和软骨下囊变,形成关节炎。膝关节是关节软骨退变最常见部位,致残率高。中医药在治疗骨关节病方面,有丰富的经验,临床疗效也较好。很多学者对中药诱导干细胞软骨分化,治疗骨关节炎的作用机理做了深入研究。本文就相关实验研究情况做一综述。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞（MSCs)的方法，诱导其表达软骨细胞表型。方法 抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导，观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果 ①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁，可提高细胞分离率；②TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs增殖，表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论 ①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF－β，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型。     

脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化研究

目的:分析脂肪干细胞体外培养的特性和体外向成脂细胞和成软骨细胞分化的情况.方法:采集成年兔腹部脂肪组织,体外分离培养脂肪干细胞,并进行成脂细胞和成软骨细胞的体外诱导分化,采用油红O染色证明成脂细胞分化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色证明成软骨细胞分化.结果:脂肪干细胞形态为菱形,细胞可稳定传代,各代次间无形态上的差异.经油红O染色发现,脂肪干细胞可形成阳性脂滴,表明具有成脂分化能力.经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色后发现,脂肪干细胞可形成Ⅱ型胶原和硫酸蛋白聚糖,表明具有成软骨分化能力.结论:脂肪干细胞具有成脂成软骨分化能力,可成为脂肪和软骨组织工程研究的种子细胞.     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的:观察人脂肪基质干细胞(ADSCs)体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:(1)人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增.(2)取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记;成脂和成软骨诱导分化.(3)倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝(AB-PSA)染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况;RT-PCR检测相关标志基因表达.结果:(1)体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定.(2)经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RT-PCR检测到有Leptin、PPAR-γ表达;经成软骨诱导,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT-PCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达.结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞.     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞

目的:体外诱导大鼠脂肪干细胞为雪旺细胞样细胞?方法:分离?培养和鉴定大鼠脂肪干细胞;表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠脂肪干细胞为神经球,并对神经球进行鉴定;视黄酸?forskolin?血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)及heregulin等诱导神经球为雪旺细胞样细胞,并对雪旺细胞样细胞的形态和表面标志物进行鉴定?结果:大鼠脂肪干细胞为成纤维细胞样单层贴壁细胞,表达间质细胞标志物fibronectin,不表达神经干细胞标志物nestin,并能进行成脂和成骨分化?大鼠脂肪干细胞能被诱导为悬浮生长的神经球;神经球表达nestin,不表达fibronectin,并能进一步分化为雪旺细胞样细胞?雪旺细胞样细胞呈双极或三极,并表达雪旺细胞经典标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)?S100和p75?结论:大鼠脂肪干细胞能在体外分化为雪旺细胞样细胞?这种雪旺细胞样细胞对于治疗神经系统疾病具有重要意义?     

不同方法制备兔自体富血小板血浆凝胶支架促进脂肪干细胞增殖比较

目的探讨不同浓度及离心方法制备自体富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）凝胶支架对脂肪干细胞（adipose derived stem cells,ADSCsl增殖及生长因子释放的影响。方法取新西兰大白兔动脉血分别采用二次及三次离心法制备自体富血小板血浆支架,检测其中的血小板浓度,同时通过添加DMEM培养基将PRP中血小板绝对浓度调整为相同的1000×109／L,之后继续向其中加入培养基将PRP按体积分数调整为30％、40％、50％、60％的不同浓度,并设置仅含培养基的空白对照组。之后向各组PRP中植入经荧光染色的脂肪干细胞（ADSCs）。7d内每日观察计数细胞数目绘制细胞生长曲线,在第2、3、4、6天用MrITr比色法分析各组脂肪干细胞的存活和增殖能力,通过ELISA定量检测培养7d后PRP脂肪干细胞复合体中生长因子TGF—B1及细胞的Ⅱ胶原含量。结果二次离心法及三次离心法所制备的PRP中血小板浓度分别为（1320．5±227．31×109／L及（1724．5±316．31×10。／L,为全血中血小板浓度的5．4及7．1倍,三次离心法所制备的PRP中血小板浓度明显高于二次离心法（P〈0．05）。采用两种离心方法所制作的PRP细胞复合体中的脂肪干细胞数目均在其PRP其中血小板浓度为500×109／L时达到最高值,分别为（1．02±0．13）×104及（1．00±O．14）×10。（P〉0．05）。各组不同浓度的PRP浓度的PRP细胞复合体中当其中血小板浓度达500×109／L时其中脂肪干细胞数目、活性均为最高,且其中的TGF—B1及细胞的Ⅱ胶原含量也高于其他各组俨〉0．05）。结论三次离心法制备PRP,血小板收集率较二次离心法高,但在促进脂肪干细胞增殖上无明显差异。PRP中血小板浓度达500×109几左右时,其中的脂肪干细胞增殖及活性达到最高,可能是制备PRP脂肪干细胞复合体的最适浓度。     

In vitro chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Summary In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCs were induced with H-DMEM containing TGF-β3. IGF I. Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindle-like appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum. Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when inducedin vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering. ZHANG Yufu, male, born in 1976, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Basic Science Research and Development Foundation (2001AA216031).     

不同浓度人脂肪干细胞与脂肪颗粒混合种植对裸鼠脂肪细胞增长的影响

目的 探讨不同浓度脂肪干细胞对自体脂肪移植的作用,为临床提供理论依据。方法 BALB/c裸鼠随机分为4组（n=2）,裸鼠背部两侧筋膜下分别注入0.5mL待移植脂肪颗粒与不同浓度脂肪干细胞的混合物,脂肪干细胞浓度如下： 200μL脂肪颗粒.A组1×106、B组1×105、C组1×104脂肪干细胞,D组（对照组）注入单纯脂肪颗粒。每2周测量脂肪团块长短径观察裸鼠背部脂肪团块生长情况。6周后处死裸鼠,取出脂肪组织,称质量,H-E染色及CD31血管免疫组化染色对脂肪组织存活、脂肪细胞形态及组织血管化状态进行评价。结果 脂肪团块长短径测量显示,脂肪团块均有缩小且各组间差异无统计学意义。6周后,A、B、C、D各组之间脂肪组织质量差异均有统计学意义（P<0.01）。H-E染色提示B、C、D组脂肪细胞生长良好。CD31血管免疫组化检测显示B组微血管形成情况良好。结论 脂肪干细胞浓度过高时,与脂肪组织的生长竞争导致脂肪细胞的存活率降低。受区空间容量也对脂肪干细胞混合脂肪颗粒的生长产生了影响。     

Neurogenesis of adipose-derived stem cells in hydrogel

Adipose tissue is a readily available source of adult stem cells with multipotent properties suitable for tissue engineering and regenerative medical applications. Peptide hydrogel is a novel biomaterial which provides three-dimensional microenvironments for a variety of cells for tissue grafting. In this study, adipose-derived stem cells (ADSCs) were isolated from rats, seeded into the peptide hydrogel polymer scaffolds and cultured in Neurobasal (NB) media supplemented with B27, basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF). Ten days after the culture, some cells were expanded into clonal populations in which the expression of both Nestin and Brdu was detected but only Brdu expression was detected in the cells that were not expanded into clonal populations. Our results suggested that ADSCs in peptide hydrogel polymer scaffolds can be induced to differentiate into cells capable of expressing the neuron-associated markers, self-renewal and self-propagation.