血管紧张素转换酶2基因转染对人内皮细胞MIF表达的影响

目的：探讨重组血管紧张素转换酶2（ACE2）基因转染对体外培养的人血管内皮细胞中由血管紧张素（Ang）II诱导的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的影响。方法:克隆和构建含人ACE2基因全长的重组质粒（pACE2），并将之转染入人血管内皮细胞中。分别采用实时定量PCR和Western印迹技术检测转染细胞中的MIF mRNA与蛋白表达情况。结果: Ang Ⅱ（100 nmol/L）和Ang IV（100 nmol/L）刺激后均可诱导人血管内皮细胞中MIF mRNA及蛋白表达增加（P<0.01）。pACE2基因转染可明显抑制内皮细胞中由Ang II和Ang IV诱导的MIF mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: ACE2基因过表达可明显抑制人内皮细胞中炎症介质MIF的表达，提示ACE2基因具有一定的抗炎症效应。通过调节ACE2基因的活性和表达，很可能为炎症相关疾病如动脉粥样硬化治疗提供新的策略。     

CTGF反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成的抑制效应

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的抑制作用。 方法： 差速贴壁法分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)。反义、正义、错义CTGF寡核苷酸分别经阳离子脂质体介导转染CFs，并与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)10-6mol/L共培养48 h，采用MTT法测CFs生长数目，羟脯氨酸法测胶原蛋白含量，RT-PCR法及Western blotting法分别测CTGF mRNA及蛋白水平的表达。 结果： AngⅡ可以在mRNA及蛋白水平明显促进CFs CTGF的表达(P<0.01)，且呈浓度-时间依赖性。CTGF反义链组的MTT反应A值、胶原蛋白含量、CTGF mRNA及蛋白水平的表达量均明显低于AngⅡ组（P<0.01），而CTGF正义链组和错义链组与AngⅡ组无显著差异(P>0.05)。 结论： AngⅡ刺激下产生的CFs CTGF mRNA和蛋白水平的表达上调，可能是心肌纤维化传导通路中的关键环节，CTGF反义寡核苷酸可以序列特异性地阻断CTGF的介导，从而抑制AngⅡ对心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的诱导作用，进一步证实CTGF可能是拮抗心肌纤维化的特异性靶位。     

NF-κB“decoy”寡核苷酸对LPS诱导巨噬细胞IL-10表达的影响

目的：探讨NF-κB “decoy”寡核苷酸（ODNs）对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞株J774.1表达IL-10的影响。方法： 通过体外细胞培养技术，观察转染NF-κB“decoy”ODNs对LPS刺激巨噬细胞产生IL-10及其表达的影响。结果： 在LPS刺激的巨噬细胞中转染NF-κB“decoy”ODNs对抗炎介质IL-10的合成表达无影响。结论： NF-κB“decoy”ODNs不抑制抗炎介质IL-10的表达，可能由于NF-κB在IL-10转录机制中不占主导地位。     

表达载体介导的反义RNA抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的：研究表达载体介导的反义RNA对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。 方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义RNA的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，建立可表达MIF反义RNA的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA的表达水平。 结果:正确构建了MIF反义RNA的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF 反义RNA对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%（P<0.05）。建立稳定表达MIF反义RNA的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制，表达水平降低40%（P<0.05）。 结论:表达载体介导的反义RNA能有效地抑制MIF的表达，建立了稳定表达MIF反义RNA的HUVECs。     

HBV X蛋白即时高表达上调巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的：将乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx转染巨噬细胞,观察X蛋白即时高表达对巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β的影响,为进一步研究HBVX蛋白的致病机制奠定实验基础。方法：将真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24小时后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Westernblot鉴定X蛋白在巨噬细胞中的表达,并用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测pcDNA3.1（＋）-HBx转染的巨噬细胞不同时间（12、24、48小时）培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β的含量,统计软件SPSS13.0分析所得数据。结果：将真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx转染巨噬细胞,Westernblot结果显示pcDNA3.1（＋）-HBx能在巨噬细胞中表达约17kD的目的蛋白,即X蛋白;ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量,LPS刺激组及pcDNA3.1（＋）组与空白对照组有显著性差异（P〈0.01）,pcDNA3.1（＋）-HBx组与LPS刺激组及pcDNA3.1（＋）组有显著性差异（P〈0.01）,而LPS刺激组与pcDNA3.1（＋）组无显著性差异（P〉0.05）,即LPS可活化巨噬细胞分泌细胞因子,且X蛋白即时高表达可引起LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β明显增加。结论：乙型肝炎病毒X蛋白即时高表达上调LPS刺激的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。     

siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

目的：构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）特异性siRNA重组逆转录病毒载体，将其导入PHOENIX细胞中，筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞，其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达，并初步了解稳定沉默MIF细胞株的特性。方法:体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体，构建的载体通过酶切、测序鉴定后，采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX，收获病毒上清；将其感染HeLa细胞株，经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western blotting鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性。结果:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装病毒细胞株PHOENIX，病毒上清感染HeLa细胞，抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降，不依赖支持物生长的特性减弱和黏附能力下降，同时稳定表达沉默MIF蛋白的细胞株生长周期停留在G0/G1期与对照组相比凋亡减少。结论:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装细胞所产生的病毒上清，能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达，表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。     

bFGF mRNA、bFGF及FGFR1与神经胶质瘤细胞恶性行为的相关性

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）及bFGF mRNA三者与肿瘤细胞（神经胶质瘤细胞）恶性行为的相关性。方法：设计、合成bFGF反义寡核苷酸，转染SWO-38神经胶质瘤细胞，用原位杂交、免疫组化及图像分析、间接ELISA、细胞增殖MTT法、细胞集落形成等方法，分别检测转染前后bFGF、FGFR1、bFGF mRNA表达的改变，观察不同剂量bFGF反义寡核苷酸转染后细胞生长、集落形成的变化。结果：大部分细胞bFGF mRNA和细胞生长可被bFGF反义寡核苷酸抑制，细胞生长的抑制呈浓度依赖性，最高抑制率可达到48％，其抑制作用可被外源性bFGF完全逆转；反义寡核苷酸处理组大部分细胞表达的FGFR1减少、细胞分泌的bFGF明显减少，集落形成抑制率达35％．外源性bFGF的逆转作用为8％。正义组和阴性对照组均无以上的明显改变。结论：揭示了反义寡核苷酸可特异性抑制bFGF mRNA和肿瘤细胞的bFGF合成表达，但不能拮抗外源性bFGF结合bFGFR的生物学作用；FGFR1随肿瘤细胞SWO-38中bFGF表达水平的降低而下调。     

siRNA沉默MIF基因对糖皮质激素抑制脂质炎症介质释放的影响及其机制

 目的： 研究小干扰RNA（siRNA）阻断巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration-inhibitory factor,MIF）基因表达对糖皮质激素抑制脂质炎症介质释放的影响及其细胞内机制。方法：体外培养小鼠巨噬细胞系RAW2647,采用免疫荧光法观测siRNA转染效率,RT-PCR检测MIF mRNA的表达,Western blotting检测MIF蛋白的表达;RAW2647细胞转染MIF siRNA后观察地塞米松（Dex）抗炎作用的变化,用ELISA检测细胞上清中前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)的含量,Western blotting检测胞浆膜联蛋白Annexin 1和下游胞浆磷酸酯酶A2α（cPLA2α）的蛋白表达变化。结果：与阴性对照相比,MIF siRNA能有效阻断细胞内源性MIF蛋白的表达,增强RAW2647细胞对Dex作用的敏感性;明显增强Dex抑制PGE2和LTB4产生的效应,增加胞浆蛋白Annexin 1的表达,抑制cPLA2α的磷酸化。结论：MIF siRNA能增强糖皮质激素抑制脂质炎症介质PGE2和LTB4的释放,且可能是通过影响Annexin 1-cPLA2α信号通路实现的。阻断内源性MIF蛋白的表达可显著增强RAW2647细胞对糖皮质激素抗炎作用的敏感性。     

RNA干扰对人肺泡上皮A549细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达抑制作用

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)干扰对人肺泡上皮A549细胞株MIF基因表达的影响.方法将MIF siRNA用转染剂Interferin介导转染体外培养的A549细胞,通过RT-PCR方法观察不同浓度MIF siRNA转染后,对MIF mRNA表达的影响;采用细胞免疫荧光方法分析MIF蛋白表达的强弱;应用MTT方法测定MIF siRNA转染对细胞的毒性,及脂多糖(LPS)刺激对A549细胞生存率的影响.结果 (1)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,可下调细胞中MIF mRNA的表达,只有当MIF siRNA转染浓度大于50 nmol/L时,才能明显下调MIF mRNA的表达;(2)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,A549细胞MIF的荧光蛋白表达也明显降低,在此基础上再加入MIF刺激,MIF的蛋白表达又明显增加;(3)MIF siRNA转染对A549细胞几乎没有毒性,且对LPS刺激A549细胞导致细胞死亡及细胞的生存率下降有一定的保护作用.结论 MIF siRNA能在A549细胞特异沉默目的基因MIF和抑制MIF蛋白的表达,且对LPS刺激导致细胞死亡有一定的保护作用.     

内毒素体外诱导巨噬细胞炎症蛋白-2γ的表达

目的：体外研究内毒素对巨噬细胞炎症蛋白—2γ(MIP-2γ)表达的作用。方法：选用小鼠单核-巨噬细胞株RAW264．7及原代培养的BALB／c小鼠肾脏细胞用LPS刺激，以实时荧光定量RT—PCR检测不同时间点MIP-2γ mRNA表达水平的变化。结果：RAW264．7细胞在LPS刺激后2h，MIP-2γ mRNA表达水平快速到达峰值(较正常水平增加约7倍)，以后缓慢下降，至刺激后16h基本恢复正常水平。原代培养肾脏细胞经LPS刺激后12h，MIP-2γ mRNA表达水平增长约50倍。结论：LPS在体外可明显诱导单核-巨噬细胞和肾脏细胞MIP-2γ mRNA的表达，提示MIP-21参与了炎症过程。     

The effects of calbindin D-28K and parvalbumin antisense oligonucleotides on the survival of cultured Purkinje cells.

The role of calcium binding proteins, calbindin D-28k (CaB) and parvalbumin (PV) in Purkinje cell survival was investigated using oligonucleotide antisense strategy. Purkinje cell enriched cultures were prepared from the cerebella of 0-1 day old Balb/c mouse pups. Purkinje cells were identified by size, asymmetric arbors, immunoreactivity to CaB and PV, uptake of gamma-aminobutyric acid (GABA) and failure to express glial fibrillary acidic protein. The cells at different days in vitro were treated with antisense or mismatched antisense phosphorothioate oligonucleotides for CaB and PV mRNA (complexed with lipofectin). Neuronal specific [3H]-GABA uptake was used as a measure of Purkinje cell survival. The cultures treated for 24 h with antisense oligos (CaB+PV) showed a significant decrease in [3H]-GABA uptake as compared with the cultures treated with lipofectin alone or with lipofectin + mismatched antisense oligos to CaB and PV mRNA. The results of the present study suggest that the expression of calcium buffering proteins CaB and PV may have a significant involvement in Purkinje cell viability.     

核转录因子在二氧化硅刺激巨噬细胞产生细胞因子中的作用

目的 探讨二氧化硅(SiO2)刺激巨噬细胞生成肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)-β1增多的分子机制及核转录因子Egr-1和NF-κB介导的信号通路在硅肺发生发展中的作用。方法 Egr-1或NF-κB抗体和反义寡核苷酸分别处理巨噬细胞后,用ELISA法检测细胞上清液中TNF-α蛋白的含量;免疫细胞化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测细胞中TGF-β1蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α和TGF-β1mRNA的表达。结果 与非抗体处理组比较,SiO2刺激下抗体处理组巨噬细胞生成TNF-α蛋白和TGF-β1蛋白减少,其mRNA表达也相应下降(P<0.05);与未转染和转染正义寡核苷酸的细胞相比,Egr-1或NF-κB反义寡核苷酸转染细胞后,在SiO2刺激下巨噬细胞生成TNF-α蛋白和TGF-β1蛋白减少,二者mRNA表达也相应下降(P<0.05)。结论 SiO2刺激巨噬细胞生成TNF-α和TGF-β1可能主要是经核转录因子Egr-1和NF-κB介导,Egr-1与NF-κB抗体和反义寡核苷酸的应用可能会导致早期肺泡炎的活动性下降,延缓或阻止肺纤维化的形成。     

Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Regrowth after Mechanical Injury in Vitro Are Egr-1/NGFI-A-Dependent

Smooth muscle cell (SMC) proliferation is a key event in renarrowing of blood vessels after balloon angioplasty. Mechanical injury imparted to the arterial wall in experimental models induces the expression of the immediate-early gene, egr-1. Egr-1 binds to and activates expression from the proximal promoters of multiple genes whose products can, in turn, influence the vascular response to injury. Here, we used antisense strategies in vitro to inhibit rat vascular SMC proliferation by directly targeting Egr-1. A series of phosphorothioate antisense oligonucleotides of 15 base length and complementary to various theoretically accessible regions within Egr-1 mRNA were synthesized and assessed for their ability to selectively inhibit SMC proliferation in an Egr-1-dependent manner. Western blot analysis revealed that two oligonucleotides, AS2 and E11, inhibited Egr-1 synthesis in cells exposed to serum without affecting levels of the zinc finger protein Sp1. AS2 and E11 inhibited serum-inducible [(3)H]thymidine incorporation into DNA, as well as serum stimulation of total cell numbers. Size-matched phosphorothioate oligonucleotides with random, scrambled, sense or mismatch sequences failed to inhibit. Antisense Egr-1 inhibition was nontoxic and reversible. These oligonucleotides also inhibited SMC regrowth after mechanical injury in vitro. Egr-1 thus plays a key regulatory role in SMC proliferation and repair following injury.     

LPS致大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB促进TNF-α分泌

目的: 观察脂多糖（LPS）致大鼠肺泡巨噬细胞（AMs）中核因子NF-κB活性及其调控肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌的作用。 方法: LPS作用大鼠AMs后，用电泳迁移率改变分析法（EMSA）测NF-κB活性；用特异的反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）后，Western blotting检测p65表达变化；ELISA法检测细胞上清中TNF-α的含量。 结果: 于LPS作用AMs后4 h，NF-κB活性达到峰值，24 h仍维持在高水平；作用后4 h上清中TNF-α的含量达到峰值。反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）表达后，LPS致AMs上清中TNF-α的含量显著低于未阻断组（P<0.01）。结论: LPS致大鼠AMs中NF-κB正向调控TNF-α分泌。     

巨噬细胞移动抑制因子促进肺成纤维细胞增殖和胶原合成

目的： 观察重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的作用,探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法:不同浓度的rMIF (25-100 μg/L)分别作用于MRC-5细胞12 h、24 h或48 h,用CCK-8法测细胞增殖率,羟脯氨酸法检测细胞上清胶原水平,RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达,Western blotting检测成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原。结果: 与对照组比,50 μg/L和100 μg/L的rMIF刺激24 h和48 h,显著促进MRC-5增殖(P<0.05或P<0.01)。刺激48 h后,细胞培养上清中,对照组及实验组均可检测到羟脯氨酸,100 μg/L rMIF显著促进羟脯氨酸分泌(P<0.01); rMIF能够剂量依赖地刺激Ⅰ型胶原mRNA 和蛋白合成(P<0.05或P<0.01)。结论:rMIF通过刺激成纤维细胞增殖及胶原合成,可能在哮喘气道重塑的发病机制中发挥关键作用。     

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1反义寡核苷酸对泡沫细胞形成的影响

目的：观察酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）反义寡核苷酸对泡沫细胞（FC）形成的影响。 方法： 体外培养人THP-1单核细胞系，由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞；并建立过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞系。在脂质体的介导下将针对ACAT1基因序列的反义和错义寡核苷酸分别作用于上述细胞6 h后加入Ac-LDL进行脂质负荷，以Western blotting法检测ACAT1蛋白表达，放射性同位素标记底物法检测ACAT酶活性的变化，油红O染色法观察泡沫细胞的形成情况。 结果： ACAT1反义寡核苷酸可明显抑制巨噬细胞和过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞内的ACAT酶活性，而且可明显抑制Ac-LDL负荷后泡沫细胞的形成；错义寡核苷酸则无此作用。 结论： ACAT1反义寡核苷酸可抑制ACAT的生物学活性及泡沫细胞的形成。     

硫代bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞的增殖

目的探讨硫代修饰对bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞增殖的影响。方法设计、合成bFGF寡核苷酸,聚乙烯亚胺(jetPEI)介导其转染入HepG2和Hep2细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的定位,流式细胞仪分析转染效率,MTT法检测细胞增殖。结果bFGF反/正义硫代寡核苷酸被jetPEI介导高效转染入细胞内,主要位于细胞核。反/正义硫代寡核苷酸均呈剂量时间依赖地抑制细胞增殖,相同剂量时正硫代寡核苷酸的抑制效率高于反义硫代寡核苷酸。相应非修饰反义寡核苷酸较其互补正义链能更有效抑制两种细胞增殖。核苷酸突变明显降低反义硫代寡核苷酸对细胞抑制,并不影响正义硫代寡核苷酸的细胞抑制率。反义硫代寡核苷酸明显降低细胞中bFGF表达。结论硫代修饰bFGF反义寡核苷酸在细胞内特异性结合核酸以反义机制抑制肿瘤细胞增殖,正义寡核苷酸则因硫代修饰于细胞内以非核酸特异性机制抑制肿瘤细胞增殖。     

Transforming growth factor-beta inhibits lipopolysaccharide-stimulated expression of inflammatory cytokines in mouse macrophages through downregulation of activation protein 1 and CD14 receptor expression

The septic shock that occurs in gram-negative infections is caused by a cascade of inflammatory cytokines. Several studies showed that transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) inhibits this septic shock through suppression of expression of the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory cytokines. In this study, we investigated whether TGF-beta1 inhibition of LPS-induced expression of inflammatory cytokines in the septic shock results from downregulation of LPS-stimulated expression of CD14, an LPS receptor. TGF-beta1 markedly inhibited LPS stimulation of CD14 mRNA and protein levels in mouse macrophages. LPS-stimulated expression of CD14 was dramatically inhibited by addition of antisense, but not sense, c-fos and c-jun oligonucleotides. Since TGF-beta1 pretreatment inhibited LPS-stimulated expression of c-fos and c-jun genes and also the binding of nuclear proteins to the consensus sequence of the binding site for activation protein 1 (AP-1), a heterodimer of c-Fos and c-Jun, in the cells, TGF-beta1 inhibition of CD14 expression may be a consequence of downregulation of AP-1. LPS-stimulated expression of interleukin-1beta and tumor necrosis factor alpha genes in the cells was inhibited by addition of CD14 antisense oligonucleotide. Also, TGF-beta1 inhibited the LPS-stimulated production of both inflammatory cytokines by the macrophages. In addition, TGF-beta1 inhibited expression of the two cytokines in several organs of mice receiving LPS. Thus, our results suggest that TGF-beta1 inhibition of LPS-stimulated inflammatory responses resulted from downregulation of CD14 and also may be a possible mechanism of TGF-beta1 inhibition of LPS-induced septic shock.     

雌激素对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞巨噬细胞移动抑制因子表达的调控作用*

 目的： 探讨雌激素对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的调控作用及其意义。方法: 用免疫组化鉴定子宫内膜间质细胞,RT-PCR及蛋白免疫印迹法测定MIF mRNA及蛋白的表达。结果: 子宫内膜间质细胞经雌激素作用后分泌MIF mRNA及蛋白水平明显增高。子宫内膜异位症组MIF 上调水平明显高于正常组。结论: 子宫内膜异位症内膜间质细胞中MIF的表达对雌激素的刺激呈现超敏状态,子宫内膜间质细胞内MIF表达升高,可能促进子宫内膜异位症的发生发展。