JAK2/STAT3途径在IL-6抑制LPS诱导的树突状细胞分化成熟中的作用

目的 观察JAK2/STAT3信号途径在IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)分化成熟中的作用.方法 分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养BMDCs;用相差倒置显微镜观察BMDCs的形态特点;用LPS诱导DCs成熟;采用流式细胞术观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型上的变化;Western blot检测BMDCs细胞质p-JAK2、总STAT3和P-STAT3的表达水平.结果 形态观察和FCM分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P＜0.01).Western blot结果显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDC中p-JAK2、P-STAT3表达随作用时间增加而明显上调,提示IL-6促进JAK2/STAT3信号途径活化.结论 JAK2/STAT3信号途径参与了IL-6抑制LPS诱导的BMDCs成熟过程.     

IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性DCs成熟的实验研究

目的观察白细胞介素-6(IL-6)对于内毒素(LPS)诱导的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟效应的抑制作用。方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs(BMDCs)。用相差倒置显微镜观察BM-DCs的形态特点。用LPS诱导DC成熟。采用FACS结合混合淋巴细胞反应,观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型和刺激同种淋巴细胞增殖功能上的变化。结果形态观察和FACS分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P0.05)。混合淋巴细胞反应显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs刺激同种淋巴细胞增殖的能力明显减弱,并呈剂量依赖关系(P0.05)。结论IL-6能明显抑制LPS诱导的BMDCs成熟,可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。     

辐射诱发胸腺淋巴瘤Kras基因的表达及其启动子甲基化

目的： 研究辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤Kras基因mRNA和蛋白表达的变化,并检测其启动子CpG岛甲基化状态,探讨辐射致癌的发生机制。方法：采用X射线照射30只BALB/c小鼠,建立胸腺淋巴瘤动物模型,取胸腺淋巴瘤和正常胸腺组织,分别提取总mRNA、合成cDNA和总蛋白,采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和Western blotting法分别检测Kras基因mRNA和蛋白表达水平,采用硫化测序PCR (BSP)法检测Kras基因启动子CpG岛甲基化状态。 结果：RT-PCR法检测,胸腺淋巴瘤Kras基因mRNA相对表达水平明显高于正常胸腺组织（P<0.01）;Western blotting法检测,胸腺淋巴瘤Kras基因蛋白表达水平高于正常胸腺组织近1.41倍;BSP法检测,正常胸腺组织Kras基因启动子有4个CpG位点发生甲基化,而辐射诱发胸腺瘤Kras基因启动子有1个CpG位点发生甲基化,呈去甲基化状态。结论：电离辐射可能通过Kras基因启动子去甲基化而引起Kras基因mRNA和蛋白表达水平改变,进而导致肿瘤的发生,其可能是辐射致癌的发生机制之一。     

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系.方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达.结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调.结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节.     

SOCS3与LIGHT在诱导DC分化成熟中的相互作用

目的 探讨SOCS3与LIGHT在刺激树突状细胞(DC)分化成熟过程中的相互作用.方法 用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞(BMDC).RT-PCR、Western blot检测受LIGHT刺激后BMDC中SOCS3 mRNA及SOCS3蛋白表达的时间动力学;利用反义核苷酸技术抑制SOCS3的表达,通过流式细胞术测定BMDC 表面分子CD40、CD86的表达水平.结果 LIGHT刺激后,BMDC的SOCS3 mRNA水平有不同程度增高(P＜0.05),并呈双峰度变化(分别出现在LIGHT刺激后2 h和10 h,增高幅度分别为92%和83%,其蛋白表达亦有所增加(LIGHT刺激24 h后表达量增加80%,P＜0.05);反义寡核苷酸能阻断SOCS3的表达,其对mRNA和蛋白表达的抑制率分别为49%和45%;经反义寡核苷酸处理后的BMDC在LIGHT刺激下其CD40、CD86表达均升高(P＜0.05).结论 LIGHT在刺激BMDC分化成熟过程中同时上调了SOCS3的表达;阻断SOCS3能使BMDC 对LIGHT 的反应更敏感,从而促使BMDC 成熟度更高;SOCS3对LIGHT 诱导的BMDC 分化成熟有负反馈调节作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路.方法 将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR (MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达.结果 在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P＜0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P＜0.05).结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生.     

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中甲基化的研究

目的:检测Oct-4在小鼠精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)诱导分化前后的表达及甲基化状态。方法:体外分离培养小鼠SSCs,用干细胞因子(stem cell factor,SCF)诱导其向精母细胞方向分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR,检测Oct-4在小鼠SSCs诱导分化前后的表达;运用甲基化特异性PCR检测Oct-4在小鼠SSCs诱导分化前和分化后2d的甲基化状态。结果:间接免疫荧光染色和RT-PCR显示,Oct-4在小鼠SSCs诱导前有表达,诱导2d后表达下降;甲基化特异性PCR显示,Oct-4在小鼠SSCs诱导前未发生甲基化改变,诱导2d后检测到其甲基化状态。结论:Oct-4基因在小鼠SSCs定向诱导分化中的表达下调可能是其启动子区CpG岛甲基化的缘故。     

苦参素对LPS诱导的人肾小球系膜细胞中p-STAT3和SOCS-3的影响

目的:观察苦参素对LPS诱导的人肾小球系膜细胞(HMC)中磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)和细胞因子信号抑制因子3(SOCS3)的表达及相互关系.方法:体外原代培养的HMC,分为正常组、LPS(10 mg/L)组、LPS(10mg/L)+苦参素(320 mg/L)组,每组分3个时间点(12,24,48h).采用MTT法检测HMC的增殖,RT-PCR方法检测STAT3和SOCS3 mRNA的表达,Western Blot方法检测p-STAT3和SOCS3蛋白的表达.结果:苦参素能明显抑制LPS诱导的HMC增殖,与正常组相比,p-STAT3和STAT3 mRNA的表达在12,24,48 h均上调,SOCS3蛋白和mRNA的表达也同步上调.与LPS诱导组相比,苦参素组p-STAT3和STAT3 mRNA的表达在12,24,48 h均下调,而SOCS3蛋白和mRNA表达有明显上调的趋势.结论:苦参素能抑制LPS诱导的HMC的增殖,且能上调LPS诱导的HMC中SOCS3 mRNA和蛋白表达,下调P-STAT3和STAT3 mRNA的表达,其作用可能与上调SOCS3、抑制STAT3磷酸化有关.     

PPARγ促进miR-16表达抑制脓毒症炎症反应的作用研究

目的 探讨PPARγ上调miR-16的机制及其抑制脓毒症炎症反应的作用.方法 经Real time RT-PCR检测脓毒症患者和健康者的外周血单核细胞PPARγ和miR-16的表达,分析其相关性;分别用PPARγ激动剂RGZ、PPAR γsiRNA或miR-16抑制剂(antagomir-16)处理THP-1和RAW246.7,经real time RT-PCR和Western blot检测miR-16及其靶基因IKKα的表达;细胞转染含miR-16启动子的报告基因质粒,经PPARγ激动剂RGZ或拮抗剂GW9662处理后,检测细胞报告基因活性;细胞经PPAR γ激动剂RGZ处理,再经LPS处理,ELISA检测炎症因子TNFα和IL-6的表达;LPS诱导的脓毒症小鼠经PPAR γ激动剂RGZ,或经antagomir-16预处理后,再经PPARγ激动剂RGZ处理小鼠,real time RT-PCR检测小鼠外周血单核细胞中miR-16的表达,ELISA检测血清炎症因子TNFα和IL-6的表达.结果 脓毒症患者外周血单核细胞中PPARγ与miR-16的表达均降低且二者的表达呈显著负相关(P＜0.05);PPARγ通过促进miR-16的启动子活性上调miR-16的表达,进而抑制miR-16靶分子IKKα的表达(P＜0.05);PPAR γ上调miR-16后显著抑制炎症细胞产生TNFα和IL-6(P＜0.05);PPARγ上调miR-16抑制脓毒症小鼠血清TNFα和IL-6的表达(P＜0.05).结论 激动剂活化的PPARγ上调miR-16进而抑制细胞炎症因子表达及脓毒症小鼠炎症反应.     

食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化相关性

目的:使用启动子区CpG岛的甲基化特异性PCR(MSP),分析食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化的相关性。方法:对MT-3基因启动子区的用MSP检测方法,并以DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮2'-脱氧胞(5-aza-CdR)分别处理食管鳞状细胞癌组织及HET-1A细胞株,检测MT-3基因启动子区甲基化状态变化,Western blot检测蛋白表达。结果:食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区呈甲基化状态,HET-1A细胞株MT-3基因启动子区呈非甲基化状态。采用5'-Aza-dC去除食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区甲基化后,金属硫蛋白3表达水平上升了9.2倍。结论:MT-3启动子区CpG岛甲基化可能是导致金属硫蛋白3低表达的重要机制,其结果则导致食管癌发生。