伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细菌外膜泡的关系

目的：研究伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细胞外膜泡（OMV）形成的关系。方法：将（1）携带pRST98的野生型耐药性伤寒杆菌－－ST1及ST2；（2）不含pRST98的野生型敏感伤寒杆菌－－ST3及ST4；（3）不含质粒的大肠杆菌－－E.coliK12W1485;(4)用十二烷基硫酸钠消除pRST8的突变体菌株－－ST1（R^-)及ST2（R^-)；和（5）经接合转移将pRST98导入敏感型伤寒杆菌及大肠杆菌的接合子－－pRST98/ST3、pRST98/ST4及pRST98的耐药伤寒杆菌消除pRST98前后，不含pRST98的的敏感伤寒杆菌和大鼠肝菌在导入该质粒前后，细菌形成OMV的数量和形态均无明显变化。结论：伤寒杆菌耐药质粒pRST98在体外与细菌外膜泡的形成未发现有明显关系。     

药物在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRsT98的研究

目的 探讨用中西药在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRST98的可能性。方法 将原存在于伤寒杆菌中的耐药质粒pRST98经接合转移分别导入大肠杆菌和鼠伤寒杆菌，选用双黄连和氧氟沙星对上述3种细菌进行亚抑菌浓度的消除试验，并对实验前后的受试菌分别进行K－B纸片扩散法和最小抑菌浓度法（MIC）药敏试验及质粒电泳检测。结果 两种药物在体外未能将受式菌携带的pRST98消除；但该质粒编码的耐药标志减少；部分菌株对原有药物的耐药程度明显下降。结论 双黄连和氧氟沙星能降低pRST98宿主菌的耐药性，但药物作用后同一质粒在不同宿主菌中耐药性变化的差异，显示该质粒表达的多样性和复杂性。     

伤寒沙门菌质粒pRST98的限制性核酸内切酶分析

目的 以我国特有的多重耐药伤寒沙门菌中分离的质粒pRST98为研究对象，对其除编码细菌抗药性外还能使宿主毒力增强这一独特性状产生的分子基础，用限制性核酸内切酶进行核酸酶谱分析。方法 将质粒pRST98用QIAGEN试剂盒提纯并精确害量后，选用常用9种限制性核酸内切酶消化，制作该质粒的酶切图谱。结果 用试剂盒提纯质粒，再用限制性内酶消化后得到了清晰，准确的质粒酶切图谱，其中BglⅡ，EcoRⅤ,PstⅠ和SacⅡ是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具。结论 伤寒沙门菌多效性质粒pRST98限制性核酸内切酶谱的建立，为分析该质粒的遗传特征，流行病学追踪和基因功能定位奠定了基础。     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细菌在巨噬细胞内存活关系的研究

目的　研究伤寒杆菌的不相容性C群接合性耐药质粒 pRST98对其宿主菌在巨噬细胞内存活的影响。方法　用标准系列稀释法检测 3株同源染色体伤寒杆菌———含 pRST98的野生型伤寒菌株STpRST98、经SDS人工消除pRST98的突变体菌株ST(R-)及 pRST98重新导入突变体的接合子 pRST98/ST(R-) ,研究它们在BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞M J774A .1内的存活情况。结果　巨噬细胞吞噬后 6 0min内大多数待检菌被杀死 ,但 pRST98宿主菌在巨噬细胞内的活菌数明显高于无此质粒的菌株 (P <0 .0 5 )。结论　pRST98能提高其宿主菌在巨噬细胞内的存活能力。     

推定编码嗜麦芽黄单胞菌整合酶类蛋白基因片段的克隆

目的扩增编码嗜麦芽黄单胞菌CG类受体的核酸序列。方法根据Grover报道的嗜麦芽黄单胞菌CG类受体的342 bp部分核酸序列设计的一特异引物P1和随机引物进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pUCm-T载体上,对经酶切鉴定筛选的重组质粒上的插入片段进行测序和分析。结果将约500 bp PCR产物克隆到pUCm-T载体上,经酶切鉴定筛选得到重组质粒pUCm-Int。pUCm-Int上插入片段经M13通用引物测序,510 bp克隆片段(GenBank注册号为：AY363962)的410～486 bp与柑橘黄单胞菌质粒pXAC64上的XACb0009基因的9034～8958 bp部分有84％同源序列,由510 bp核酸序列编码的169氨基酸(aa)序列的4～166aa部分与柑橘黄单胞菌XACb0009基因编码的424aa整合酶类蛋白的38～200aa序列有62％同源序列。结论克隆到的510 bp核酸序列可能是编码嗜麦芽黄单胞菌整合酶类蛋白的部分基因序列。     

基于全基因组测序的院内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药性及同源性分析

目的：基于基因组学研究医院内碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因分布，毒力情况及同源性分析，深入阐明院内感染的分子机制，为多重耐药菌株临床治疗和预防提供实验室依据。方法：收集1株临床分离的碳青霉烯耐药的泛耐药肺炎克雷伯菌，经培养鉴定，测定对常用抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），多位点序列分型（multi- locus sequence typing，MLST）进行基因分型并行全基因组测序。根据基因测序结果，选择相关耐药基因在临床收集的另外50 株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌中进行扩增检测，验证其携带情况，对测序结果进行进一步的阐述。结果：药敏结果显示该菌对除粘菌素和替加环素外的抗生素全部耐药，测序结果显示该菌染色体基因序列全长5 468 925 bp，含有4个质粒（179 972 bp、141 377 bp、85 181 bp和20 247 bp），共有5 984个蛋白质编码基因，85个tRNA基因和25 个rRNA 操纵子。此外，该菌携带有大量参与编码多种抗生素的耐药基因。MLST结果显示，该菌基因型为ST11型，该菌大部分序列与之前在四川和杭州报道的菌株类似，最接近的是一株编号SCKP020029（NCBI Accession number：CP029384）的肺炎克雷伯菌。收集的另外50株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌确认均为产超广谱β内酰胺酶（extented-spectrum beta-bactamases，ESBLs），其中97％为ST11型。脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）结果显示分属3个克隆。在这些菌株中，耐药基因检出率分别为KPC-2（98%）， SHV -11（98%），TEM -1（76%），CTX -M（76%），Oqxb1（66%），qnrS（70%），Int1（42%），sul1（82%），sul2（96%），iutA（88%）， iucABCD（10%）和rmpA2（100%）。结论：实验结果揭示了院内碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的基因组学具有高度相似性，流行病学具有聚集性和散发性交叉的特点。抗生素耐药结果提示了细菌耐药中选择性抗生素耐药压力的作用效应，同时质粒耐药基因在细菌中的传播提示这些耐药菌在院内的传播以质粒传播为主，有效的院内感染监测、隔离和控制这类质粒的传播是减少这种细菌耐药感染必不可少的措施。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析

目的 获取嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因，并将它克隆到质粒pUC18中进行核苷酸序列分析。方法 应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因，将其定向插入载体pUC18并转化大肠杆菌JM109，用限制性酶切及PCR对重组质粒进行鉴定。用双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定，并与GenBank中报道的HSP60基因进行比较。结果 成功克隆了约1647bp的HSP60基因片段，测序结果表明，所克隆的HSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98％。结论 获得了序列正确的HSP60基因，为其重组表达及相关研究奠定了基础．     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

分子佐剂小鼠补体C3d基因的克隆与序列分析

目的 构建C3d的真核表达质粒，以期将其作为分子佐剂，提高核酸疫苗的免疫效能。方法 采用PCR技术扩增小鼠补体C3d基因（897bp)，并将其克隆至pGEM-T 载体上；经鉴定其DNA序列正确；再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。结果 经DNA测序证实了该克隆片段为小鼠补体C3dA基因，可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。结论 构建了C3d真核表达质粒，为高效核酸疫苗的研究打下了良好的基础。     

多重耐药大肠埃希菌质粒介导耐药性的研究

目的：了解临床收集的多重耐药大肠埃希菌克隆播散状况及质粒介导耐药性的特性。方法通过K- B纸片法明确细菌耐药谱,脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行耐药菌株的克隆分型,了解其克隆播散情况,通过质粒接合实验获得耐药性质粒的接合菌,用PCR方法筛选接合菌株的常见耐药基因,并利用S1酶切质粒再进行PFGE的方法判读分析质粒的分子大小,分析菌株间的质粒水平迁移状况。结果临床分离95株大肠埃希菌均为多重耐药菌,对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、四环素类等药物显示出广泛耐药性,PFGE分型显示克隆传播趋势不明显。耐药菌株常携带可接合性耐药质粒,质粒分子量大小分布在40-330kb,编码多种对青霉素类、头孢菌素类等药物耐药的耐药基因,包括CTX- M型、TEM型β-内酰胺酶基因,以及质粒介导喹诺酮耐药基因qnr等等。结论临床大肠埃希菌多重耐药性严重,耐药性的快速传播已非同源克隆细菌的简单播散,可接合质粒造成的耐药基因水平转移可能起到了相当重要的作用。     

伤寒杆菌耐药质粒pR_(ST98)介导血清杀菌作用抗性的研究

将ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ 导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌、伤寒杆菌,并用十二烷基硫酸钠（ Ｓ Ｄ Ｓ） 消除耐药菌株的ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ ,计算接合子及 Ｒ 质粒消除前后菌株在人、兔及豚鼠的不同浓度、不同成份血清中的存活率。ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ 介导其宿主菌对血清杀菌的抗性,但在不同宿主菌中抵抗力不同;补体经典途径及旁路途径均参与血清杀菌过程。ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９ ８ 具有多效性,其广泛的宿主性在介导细菌多重耐药的同时,还赋予细菌抵抗血清的杀菌作用,使病原菌致病性增强。     

沙门菌质粒DNA上整合子的分析

目的分析沙门菌质粒DNA上整合子的分子特征。方法用全自动细菌分析仪Mieroscan WalkAway40和纸片扩散法,对32株沙门菌进行抗生素敏感性测定,提取细菌质粒DNA,PCR扩增Ⅰ类整合子、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶,对扩增产物进行序列分析。结果12株细菌含有一个Ⅰ类整合子,整合子大小分别为1000bp和1700bp。1000bp整合子含基因盒aadAl,1700bp整合子含基因盒dfr17-aadA5,未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合酶。结论整合子在沙门菌中广泛存在,整合子是介导和传播细菌耐药性的重要分子机制。     

人类抗砷相关基因（hARRG）的克隆和表达

克隆并表达人类抗砷基因ｈｕｍａｎ ａｒｓｅｎｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ｈＡＲＲＧ）。方法。从人胎脑中获得ｍＲＮＡ,建立ｃＤＮＡ文库,通过大规模测序克隆出一人类新基因。结果：该基因全长１１７０ｂｐ,读框为（ＯＲＦ）７２３ｂｐ,经序列分析,与中国仓鼠抗砷基因ａｒｓｅｎｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ（ａｓｒ２）同源性达８８％。根据ＯＲＦ上物,ＰＣＲ扩增,扩增产物酶切后     

伤寒沙门菌bcfD基因的克隆表达

目的构建伤寒沙门菌BcfD基因的原核表达质粒,表达BcfD蛋白。方法PCR法从伤寒沙门菌Ty2菌株基因组中扩增bcfD目的基因,经克隆和亚克隆构建原核表达载体pET-30a-bcf,将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)并进行原核表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达蛋白。结果扩增到与bcfD基因预期大小相符的片段,测序证明与bcfD基因序列完全一致,SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子质量为42×103,免疫印迹分析表明,表达产物与经用大肠杆菌吸附处理后的伤寒患者血清能进行免疫反应。结论成功构建了bcfD基因原核表达载体并在大肠杆菌中表达了目的蛋白。     

沙门菌质粒对细菌生物膜形式的影响

目的研究伤寒沙门菌质粒pRST98对生物膜形成的影响。方法将携带pRST98的野生型伤寒沙门菌于30℃和37℃培养3 d,用半定量法确定生物膜形成的适宜温度。将稀释的菌液于30℃分别培养12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和5 d,用半定量法确定生物膜成熟的时间。分别用携带pRST98的野生型伤寒沙门菌,消除pRST98的突变株及pRST98的回补株建立生物膜模型,用结晶紫染色法,半定量法和扫描电镜观察三种株受试菌形成生物膜的能力。结果在30℃培养时细菌生物膜形成能力高于37℃,此温度为沙门菌生物膜形成的适宜温度;3 d时生物膜趋于成熟;野生株和回补株形成生物膜的能力显著高于突变株。结论伤寒沙门菌质粒pRST98与该菌生物膜形成密切相关。     

多重聚合酶链反应检测食品中致病性小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌

[目的 ]快速准确地检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌 .[方法 ]根据小肠结肠炎耶尔森菌的ail基因和ST的H1 d基因顺序设计二对引物 ,通过聚合酶链反应检测食品中的小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌 ,扩增产物经电泳 ,分别出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的 170和 4 5 8bp的ail和H1 d基因片断的条带时即判定该样品为阳性 .[结果和结论 ]本法特异性强、灵敏度高 ,能在60h内出结果 ,适用于食品中小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌的快速检验 .     

鼻咽癌相关新基因NPCEDRG真核诱导表达载体的构建及鉴定

目的构建受Tet系统调控人鼻咽癌相关新抑瘤基因NPCEDRG表达的真核诱导表达载体。方法以pcDNA3．1-NPCEDRG重组质粒为模板，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增NPCEDRG基因编码区，亚克隆到pRevTRE载体，PCR及双酶切鉴定，测序验证。结果以pRevTRE—NPCEDRG重组载体为模板PCR扩增以及双酶切重组载体，分别产生530bp和520bp长度的片断，测序结果证实插入片段方向正确，序列与Genebank已知序列一致，NPCEDRG基因编码区成功插入pRevTRE载体。结论成功构建了受Tet系统调控NPCEDRG基因表达的pRevTRE—NPCEDRG真核诱导表达载体，为深入研究NPCEDRG基因功能和摁示鼻咽癌发病分子机制提供实验手段。     

spvB/spvC基因对沙门菌毒力及宿主免疫功能的影响

目的研究spvB/spvC基因对沙门菌毒力及对宿主免疫系统的影响。方法野生型沙门菌（STM.211）、敲除spvB基因的沙门
菌（STM.211-ΔspvB）、敲除spvC 基因的沙门菌（STM.211-ΔspvC）、敲除spvB 及spvC 基因的沙门菌（STM.211-ΔspvB.spvC）和PBS
组分别经腹腔注射0.2 mL105 CFU的STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-ΔspvC、STM.211-ΔspvB.spvC感染BALB/c小鼠,观察
小鼠精神状态、运动情况、腹泻、体质量、毛发改变等感染中毒症状,用ELISA法测定小鼠血清IL-10、IL-12、IFN-γ水平;并分离
小鼠肝、脾,观察靶器官大体观及显微镜下的病理改变。结果（1）STM.211、STM.211-ΔspvB和STM.211-ΔspvC组的中毒症状明
显较PBS 组严重,STM.211-ΔspvB.spvC 组与PBS 组间无明显差异;（2）STM.211 组、STM.211-ΔspvB 组、STM.211-ΔspvC 组的
IFN-γ和IL-12 分泌量均显著低于STM.211-ΔspvB.spvC 组（P<0.05）,而IL-10 的分泌量明显高于STM.211-ΔspvB.spvC 组（P<
0.05）;STM.211组、STM.211-ΔspvB组、STM.211-ΔspvC组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论（1）spvB/spvC基因缺失对沙门
菌毒力影响不明显,但spvB.spvC基因共同缺失,使沙门菌毒力减弱;（2）spvB/spvC基因相对抑制TH1细胞因子IFN-γ和IL-12的
分泌,促进TH2 细胞因子IL-10 的分泌,使免疫应答向TH2 方向偏移,从而有利于病原菌抵抗和逃避宿主的免疫防御,加重
感染结局。