定量PCR技术

聚合酶链反应（ＰＣＲ）是模拟ＤＮＡ体内复制过程,在体外将ＤＮＡ片段加人工扩增的技术,有许多因素都可以影响ＰＣＲ的扩增效率,导致常规ＰＣＲ的特异性不强,准确性不高,为此,大量学者设计了定量ＰＣＲ技术,从克服各种因素对ＰＣＲ扩增的干扰,从而提高ＰＣＲ的特异性及准确性,本文对定量ＰＣＲ技术进行了简要的综述。     

定量PCR中常用的参照系统

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立,这是一个在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的技术,可使人们快速地从试管中获得大量特异的核酸片段。PCR技术给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化,它已与DNA克隆、DNA重组和DNA测序等技术一样,成为分子生物学乃至医学研究和应用中不可缺少的工具。在医学研究和临床诊断治疗中,人们越来越多地需要对某一基因或核酸片段的量的变化进行观察和研究,如病毒在体内的复制状况和治疗过程中病毒荷载量的变化[1～3],基因受某些因素的影响…     

两种国产荧光定量PCR试剂与Roche定量试剂的比较

目的 探讨两种国产荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂以及Roche定量试剂检测乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)结果之间的相关性,分析各方法之间的差异性,比较两种国产试剂的临床应用性能,选择更适合该实验室的试剂。方法 收集用Roche定量试剂检测过的71例乙型肝炎患者血清,分别采用A、B两种试剂进行平行检测,然后对各检测结果进行比较,分析3种试剂之间的相关性和差异性;并对A、B试剂的最低检测限、最低定量限、线性范围、重复性精密度、正确度等性能指标进行验证。结果 A、B试剂的检出率均高于Roche试剂,B试剂的检出率最高,且两种国产试剂定量结果与Roche试剂比较,差异无统计学意义(P>0.05)。A试剂与Roche试剂的符合率高于B试剂;A、B试剂的定量结果与Roche试剂均有良好的相关性,相关系数分别为0.896、0.908,差异均有统计学意义(P<0.05);A试剂的最低检测限为20 IU/mL,最低定量限为100 IU/mL,线性方程为Y=-0.996X+8.925(R²=0.999),在1.0×10²～1.0×10...     

定量PCR

随着分子生物学在医学领域的广泛应用。对检测标本的核酸定量已显得十分必要,PCR技术是一种较为理想的方法。本文介绍了近几年国外在这方面的研究进展。     

定量PCR的研究进展

定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的基因定量技术，克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。本文就定量PCR技术中的竞争性PCR和荧光定量PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。     

内标荧光定量PCR技术在乙型肝炎病毒定量中的应用

目的　建立内标荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒 (HBV)DNA ,以避免PCR扩增过程中可能出现的假阴性或部分抑制。方法　在TaqMan荧光探针杂交PCR技术检测HBV载量的基础上 ,结合内标参照的方法指示PCR的扩增效率。结果本检测方法具有很好的特异性、重复性 ,检测敏感度达到 1× 10 3 copies/ml。经过对 382例乙肝患者标本测定证实 ,标志物为HBsAg( )、HBeAg( )、抗HBc( )的血清检出率为 10 0 % ,标志物为HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出率为 72 .0 % ,与Roche试剂比较 ,两者的相关系数为 0 .987。结论　本法快速、简便、特异性好、能指示病毒感染程度。     

应用生物发光技术定量检测PCR扩增产物

目的　建立一种基于生物发光技术的定量检测PCR产物的方法 ,并用于HBV定量PCR检测。方法　首先利用ATP硫酰化酶 (ATPsulfurylase)将焦磷酸 (PPi)定量转化成ATP ,然后利用虫荧光素酶 (luciferase)系统发光检测ATP ,从而确定样品中PPi含量。利用 2次PCR法扩增HBVDNA目的片段 ,并进行回收纯化定量 ,以之作为阳性标准模板制作标准曲线。选择适当的循环次数扩增样品中HBVDNA ,利用化学发光法检测扩增产物中PPi的量 ,进而确定样品中HBVDNA模板的量。结果　当起始模板量为 (10～ 5 )× 10 5拷贝 ,循环次数为 2 5 ,发光值与起始模板浓度呈现良好的相关。检测 32份样品血清 ,其中 2 3例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中HBVDNA平均含量为 1 6× 10 5拷贝 / μl,9例HBsAg(+)、HBeAg(- )、HBcAb(+)标本中HBVDNA平均含量为 5 6× 10 3 拷贝 / μl。结论　本方法是一种操作简便、灵敏度高的定量PCR方法     

HBV—DNA荧光定量PCR检测下限的确立

目的 确立本实验室荧光定量PCR检测HBV-DNA项目的检测下限.方法 分别测定原倍HBV-DNA质控血清及经100、200倍稀释后HBV-DNA含量.结果 原倍质控血清测定结果的均值为3.63×104 IU/mL（4.56）,在给定靶值范围2.14×104～2.14×105 IU/mL（4.33～5.33）的低值附近;100倍稀释后的检测结果的均值为3.32 × 102 IU/mL（2.52）,在试剂盒最低检测下限（500 IU/mL）以下,且100份标本能100%定量检测.结论 本实验室设备及所用的试剂、方法对HBV-DNA〉500 IU/mL的标本完全有能力定量检测;检测下限为500 IU/mL是符合要求的.     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒（HBV）DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）是目前测定HBVDNA较为简便、敏感和特异的方法。影响实时荧光PCR准确定量的因素很多．我们在对血清HBVDNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则（以下称“异常扩增曲线”），致检测结果明显偏低，对此我们进行了分析。     

荧光定量PCR检测巨细胞病毒感染的临床分析

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又称人类疱疹病毒5型，属于疱疹病毒亚科。HCMV是有包膜的DNA病毒，为双链线性DNA分子，其基因组长约240kb。HCMV具有高度种属特异性，只能在人成纤维细胞中培养增殖，并可产生典型的细胞病变：细胞膨胀增大，细胞核及胞浆内出现包涵体。HCMV在体内除了可感染人成纤维细胞外，还可感染表皮细胞、内皮细胞、精子细胞及巨噬细胞等，引起巨细胞包涵体病、输血后传染性单核细胞增多症、先天畸形、肝炎、间质性肺炎及视网膜炎等疾病。     

定量PCR技术的研究进展

定量ＰＣＲ技术的研究进展陈建魁综述牟兆钦审校（军事医学科学院附属医院，北京１０００３９）关键词定量ＰＣＲ核酸检测技术聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平。但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是...     

荧光定量PCR法检测肿瘤细胞株转录因子表达水平

目的 建立荧光定量聚合酶链反应(fluorogenic quantitative PCR)检测方法，以便快速、准确地定量检测细胞株转录因子表达强度。方法 根据基因序列，设计合成引物．采用一步法提取细胞株总RNA，逆转录获取cDNA，通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T—box expression in Tceils(T—bet)，GATA3的表达水平进行检测。结果 细胞株NK92、QBC939、K562、HO-8910、A549、HeLa转录因子T—bet的表达强度分别为0．90、1．25、0．96、0．92、1．1l和1．17，GATA3的表达强度分别为1．23、1．49、1．30、0．97、1．05和1．34。结论 建立丁肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法，较常规PCR方法更为简便、快速、准确，有很好的应用前景。     

PCR扩增产物的量化检测技术

随着分子生物学的日益发展及普及,ＰＣＲ产物的定量检测受到了广泛重视。本文将近年国外报道ＰＣＲ扩增产物的量化检测技术的某些方面的原理,特点等作简要的介绍。并着重介绍杂交酶免疫测定法的优点及其广阔的应用前景。     

TaqMan实时定量RT—PCR与常规RT—PCR检测登革病毒的比较

目的:比较TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)法与常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测登革病毒的敏感性、特异性和时效性。方法:建立TaqMan实时定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法,分别对登革病毒、乙型脑炎病毒及西尼罗病毒进行检测,并比较两法的特异性、敏感性和时效性。结果:两种方法都能检测出登革病毒,而对乙型脑炎病毒和西尼罗病毒的检测呈阴性;常规RT-PCR的敏感性为0.1TCID50/mL,TaqMan实时定量RT-PCR的敏感性提高了100倍,达到了0.001TCID50/mL,且至少节约了2h。结论:与常规RT-PCR比较,TaqMan实时定量RT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速诊断。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

竞争性定量聚合酶链反应的评价

聚合酶链反应（PCR）用于定量研究是该项技术的一大难点，因为常规PCR只能给出阳性或明性结果。虽然从理论上讲，扩增产物的星与初始模板浓度呈现指数关系，但实际上由于临床标本中抑制物的存在及PCR过高的敏感性，可使同一份标本的DNA样品在不同管中扩增会得出完全不同的结果，即所谓的“试管效应””’。为了解决这一问题，许多作者采用同一管中共同扩增内参照模板，即所谓的差别PCR等‘”。该方法的最大缺点是，内参照模板和待测定的靶序列性质不同，需要选用不同的引物，两者的扩增效率可能完全不同，且只能给出相对含量，不能求…     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌

目的利用实时荧光定量聚合酶链反应（实时PCR）方法进行肺炎链球茵的检测和流行病学调查。方法用实时PCR技术扩增并检测400例临床标本的肺炎链球菌的自溶素（1yt）基因,并将其与传统的培养法进行对比。结果400例,临床标本中,实时PCR检测肺炎链球菌为阳性的有78例（阳性率为18％）,传统培养法结果为阳性的有29例（阳性率为7．25％）。结论实时PCR是一种灵敏、特异、快速的检测肺炎链球菌方法,其可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查。     

定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植中的应用

巨细胞病毒（CMV）感染是肾移植受者发病和死亡的重要原因。本文就定量PCR在预测肾移植受者CMV感染的症状发作期及监测更昔洛韦的疗效等方面的价值进行阐述。     

荧光定量PCR检测生殖道内沙眼衣原体感染的分析

目的 :评价DNA定量测定技术在生殖器衣原体感染诊断中的应用价值。方法 :比较DNA定量测定与传统检测手段对衣原体感染的检测结果。结果 :用DNA定量测定法检测衣原体感染 ,其敏感性和特异性均比传统的方法高。定量测定结果显示 ,衣原体感染者最高 2× 10 8copy/ml,最低 2× 10 2 copy/ml。结论 :CTDNA定量测定标本取材要求不是很严格 ,不宜用作短期判愈 ,在CT诊断中有巨大的潜力