清酒酵母(Saccharomyces sake)WQ3发酵制备S-腺苷甲硫氨酸的研究

从4株清酒酵母中筛选获得S-腺苷甲硫氨酸(SAM)积累量较高的WQ3,对该菌株发酵生产SAM的培养条件和分离纯化进行了研究.通过正交试验,得到的优化培养基组成为:蔗糖8%、胰蛋白胨1.2%、L-甲硫氨酸1%、酵母提取物0.75%、MgS04·7H20 0.03%、KH2PO4 0.4%,优化后摇瓶发酵SAM产量可达到2...     

人血管生长素重组大肠杆菌发酵条件优化

考察了Mg^ 、Ca^ 、NH^ 4、PO^3-4-等无机离子、初始pH、装液量以及诱导前添加葡萄糖对重组大肠杆菌表达rhANG和菌体生长的影响。经过优化，rhANG表达量提高约39％，菌体干重达1．59g／L，为工程菌发酵的扩试提供了参考。     

重组人血管生长素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达重组人血管生长素 (rhANG)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵 ,研究不同宿主菌对表达rhANG的影响 ,同时对培养基、诱导时期、诱导时间和初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用E .coliCDH为宿主菌 ,在SOB培养基中培养至A6 0 0nm 为 0 .5～ 0 .6时 ,诱导表达 5h ,rhANG表达量最高达 30 %。重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高rhANG的表达量 ,为发酵规模的扩大奠定了基础     

重组Pichia pastori高密度培养和表达过程的溶氧调控

在重组人血清白蛋白（recombinant human serum albumin，rHSA）Pichia pastori表达系统中，研究了高密度培养时细胞生长、改变碳源和诱导表达时溶氧的变化和调控规律，溶氧与细胞生长和重组蛋白表达密切相关。发酵前期的细胞生长阶段，细胞需氧降低表明碳源甘油的消耗，根据溶氧水平适时流加碳源甘油；改变碳源前，应停止流加甘油碳源，并以溶氧指标判断甘油是否消耗完全；重组蛋白诱导时流加甲醇的速度应缓慢增大，并保持细胞一定的需氧水平。高密度培养时通过流加底物速度、搅拌转速、通气量和富氧培养来关联控制发酵液溶氧水平。     

重组人内皮抑素工程菌发酵条件的优化

重组人内皮抑素(rhEndostatin)是人内皮抑素经过基因突变获得的新的蛋白质序列,是一种血管生成抑制剂类蛋白,具有抗肿瘤活性.实验对蛋白rhEndostatin产生菌E. coli BL21(DE3)的基本发酵条件进行了研究并用正交试验对培养基成分进行了优化,优化后的培养基组成为:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,葡萄糖0.5%,NaC1 0.2%,Na2 HPO4·12H2O 1.5%,KH2PO4 0.2%,(NH4)2SO4 0.2%,MgSO4·7H2O 0.02%,VB15mg/L,VB2 1 mg/L,微量元素:CoCl2·6H2O 5 mg/L,MnCl2·4 H2O,H3BO3,Na2MoO4·2H2O,AICI3·6H2O,Ferric citrate均20 mg/L.优化后的培养基在发酵罐发酵,湿菌重达到45 g/L以上,目的蛋白产量达324 mg/L,为rhEndostatin的进一步研究开发打下了基础.     

根霉产生抗生物质发酵条件初步研究

通过对不同培养基及不同C源、N源、接种量等影响因素的单因素多水平实验,确定了最佳发酵工艺;以5%麸皮水,1%玉米浆为培养基,初始pH4.0,种龄为10h,接种量5%,装液量5%,装液量100mL/500mL三角瓶,160r/min,30℃,发酵48h,在优化后的条件下,培养基的成本及制作时间均降低,而且总活力提高为140U/mL。     

表达重组人生长激素的大肠杆菌高密度发酵的初步试验研究

根据表达重组人生长激素的大肠杆菌的自身特点，对其发酵的工艺和条件作了初步的研究和改进，通过以甘油代替葡萄糖作为培养基中的碳源，以流加的方式在发酵过程中逐步补加；同时，通过控制搅拌转速，以控制溶氧不低于２０％的水平，在发酵的中后期，再以流加的方式补充适量的蛋白胨等营养成份，使发酵终止时，大肠杆菌的密度由３０ｇ／Ｌ提高至９０ｇ／Ｌ，而ｒ－ｈＧＨ的细胞表达量并未因此而受到影响，发酵周期从１６ｈ缩短到１０     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

溶氧对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

目的考察发酵液中不同的溶氧浓度对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响。方法通过改变通气量、搅拌转速和辅助通入纯氧的方式将发酵液中溶氧浓度控制到试验设定值。结果当控制发酵液中溶氧浓度在30%时,SAMe产量最高。结论通过控制发酵液中溶氧浓度有助于提高重组毕赤酵母高密度发酵高表达腺苷蛋氨酸。     

重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化

采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10.以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20％,菌体密度(D600) 0.55～1.4,42℃诱导表达2～3h,目的蛋白相对表达量由优化前的25％提高至4...     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。     

发酵条件对毕赤酵母工程菌产rhBSP的影响

Pichia pastrois酵母工程菌GSll5／pPICZaA—hbsp能分泌表达重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)。本文通过其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达rhBSP的最适条件。以BMGY作为种子培养基，菌体密度A500达到9时，重悬于1／5体积的BMMY培养基中，A500达到45，pH值6．0，2％甲醇诱导4d，rhBSP产量达高峰期，最大表达量为0．255g/L。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。     

木瓜凝乳酶基因克隆及毕赤酵母分泌型重组表达载体构建

目的扩增木瓜凝乳酶基因 ,构建重组表达载体。方法提取木瓜组织RNA ,采用RT PCR方法扩增木瓜凝乳酶基因 ,测序并利用BLAST软件进行序列分析。利用基因重组方法构建重组表达载体。结果扩增得到木瓜凝乳酶基因。结论构建了可在毕赤酵母表达系统中表达天然木瓜凝乳酶蛋白的重组表达载体。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响

考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略(恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度)对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子(hALR)的影响。控制恒定甲醇浓度为10g/L诱导时,甲醇比消耗速率和hALR表达速率显著高于其它两种流加策略,最终hALR表达水平为360mg/L。     

毕赤酵母表达阿片肽发酵条件的研究

研究了由毕赤酵母胞内两步发酵法表达活性小分子阿片肽的条件.正交实验确定最佳生长条件为:甘油24g/L、酵母膏11g/L、蛋白胨22g/L、YNB 20ml/L,初始pH5.0.菌体密度可达2.46;以单因素实验确定最佳表达条件为:起始菌体浓度2.44,初始pH 6.25,每10h流加0.6%甲醇(v/v),表达时间96h.阿片肽250ml摇瓶产量由196mg/L提高至496mg/L.     

毕赤酵母高效电转化条件的研究

目的建立毕赤酵母的高效电转化方法,为利用毕赤酵母重组表达海洋药物功能基因提供方法基础。方法采用电穿孔的方法把外源DNA转化进毕赤酵母基因组中。通过对毕赤酵母生长状态,电击条件等影响因素进行探索。结果当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、电压为1.5kV、质粒浓度为0.15g.L-1和0.2cm电转化杯时,转化效率达到最大值,为每微克质粒DNA 36个转化子。经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。结论通过对电转化各种条件的优化,获得了高效电转化技术方法。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。