腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因治疗小鼠人鼻咽癌模型

目的: 研究腺病毒介导的KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)系统(AdKDR- tk)结合丙氧鸟苷(GCV)对裸鼠人鼻咽癌的治疗作用. 方法: 建立人鼻咽癌裸鼠模型, 将36只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/GCV组、AdCMV-tk/GCV组和生理盐水/GCV组,每组12只. 采用瘤内注射分别给予重组腺病毒及生理盐水,24 h后重复注射1次. 次日起连续10 d每日ip GCV 1次,100 mg/kg. 治疗结束后处死裸鼠,检测肿瘤质量、组织形态学变化及肿瘤微血管密度. 结果: AdCMV-tk/ GCV组裸鼠鼻咽癌瘤体质量(1.81±0.84)g及肿瘤微血管密度(11.54±1.56)个/mm3、AdKDR-tk/ GCV组[分别为(1.48±0.88)g,(9.87±2.18)个/mm3]与生理盐水/GCV组[分别为(2.53±1.21)g,(17.78±2.12)个/mm3]相比差异有显著性 (P<0.05). AdCMV-tk/ GCV组与AdKDR-tk/ GCV组比较也存在显著差异(P<0.05). 结论: 癌灶内注射AdKDR-tk对裸鼠人鼻咽癌生长具有明显抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的方法.     

腺病毒介导的VEGF启动子-胸苷激酶表达系统对肝癌细胞的选择性杀伤作用

目的:构建携带受血管内皮生长因子(VEGF)启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的重组腺病毒载体,并探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞的特异性杀伤活性.方法:采用AdEasy System 构建携带受VEGF启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控tk基因表达的AdVEGF-tk和AdCMV-tk,这两种重组腺病毒载体在293细胞中包装、扩增后,体外感染正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测受染细胞的增殖情况.结果:AdVEGF-tk的病毒滴度为1×1010 pfu/ml,AdCMV-tk为5×1010 pfu/ml.L02细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性无明显改变,而HepG2细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性明显增加,在感染复数(MOI)为100并用50 μg/ml GCV处理时,则有90％ 以上HepG2细胞被杀死;而AdCMV-tk可杀死95％ HepG2细胞和80％ 以上L02细胞.结论:VEGF启动子调控的HSV-tk基因表达可特异性地杀死肝癌细胞,同时对正常肝细胞几无影响.     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因(AdKDR-CDglyTK)对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法 选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞,用腺病毒重组体AdEasy-KDR-CDglyTK和AdEasy-CMV-CDglyTK感染之,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果 两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株,其表现出对前药不同的敏感性:感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(P>0.1);相比之下,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

重组腺病毒驱动KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株MCF-7及血管内皮细胞(ECV304)选择性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。并通过流式细胞仪检测前药对瘤细胞周期的影响。结果所得病毒滴度为2.0×1012pfu/ml。3种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当感染复数(MOI)为200时,所有细胞株均达约100%感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的MCF-7细胞和ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,二者敏感性差异无显著性意义(P=1.00);与前2者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。CDglyTK融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MCF-7细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0.001)。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮细胞。     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effect of adenovirus (Ad)-mediated fusion gene systemdriven by KDR promoter on the proliferation, apoptosis and cell cycle of human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The KDR-expressing ECV304 cells and LS174T cells not expressing KDR were both infected by the AdEasy-KDR-CDglyTK followed by treatment with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and/or ganciclovir (GCV) at different concentrations. The killing effects of the transfection on the cells were evaluated and bystander effects analyzed by coculturing the uninfected cells by AdKDR-CDglyTK with different ratios of infected cells. Flow cytometry was employed for determining the cell cycle distribution and electron microscopy performed to observe the pathological changes of cells. RESULTS: The infection rates of the resultant recombinant Ad (rAd) were similar in the cells and gradually increased with the increment in the multiplicity of infection (MOI) of the Ads. The infected cells exhibited different sensitivities to the two prodrugs: ECV304 cells infected with rAd were highly sensitive to the prodrugs, but the infected LS174T cells were not (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either single suicide gene (P<0.001), showing also obvious bystander effect. In addition, the cell cycle of ECV304 cells was arrested at S phase with morphologic features of apoptosis and necrosis as displayed by electron microscopy. CONCLUSIONS: CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter selectively kills the KDR-CDglyTK-expressing endothelial cells, the mechanism of which may involve cell cycle arrest and necrosis and apoptosis of the cells.     

hTERT启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒载体的构建和制备

目的构建人端粒酶逆转录酶启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒的真核表达载体,为进一步研究其在体内外实验提供依据。方法PDC312-TP质粒和PSUCMV-TK质粒经EcoR I,Sal I酶切连接构建PDC312-TP-TK,将质粒PDC312-TP-TK与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK,PSG-TP-TK在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果质粒PDC312-TP-TK经酶切鉴定正确,扩增得到的PSG-TP-TK经PCR扩增证实为hTERT启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒,腺病毒滴度为1.9×1010pfu/ml。结论该实验为重组腺病毒PSG-TP-TK用于肿瘤的基因治疗打下了基础。     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

OBJECTIVE: To observe the selective killing effect of adenovirus (Ad)-mediated double suicide gene driven by kinase domain-containing receptor(KDR) promoter on human colorectal cancer LoVo cells and human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The plasmid pAdEasy-KDR-CDglyTK was transfected into 293 packaging cells for amplification of the infectious Ad and used to infect the KDR-producing cells (ECV304 and LoVo) and the KDR-nonproducing cells (LS174T) respectively. The three cells were treated with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and ganciclovir (GCV) at different concentrations after infection. The killing effects of the fusion gene system on the cells were evaluated. The distribution of cell cycle was detected by flow cytometry. RESULTS: The infection rates of the recombinant Ad were similar among the 3 cells, gradually increasing with the increment of multiplicity of infection (MOI) and reaching 100% with the MOI of 200. The LoVo cells and ECV304 cells infected with Ad-KDR-CDglyTK were highly sensitive to both of the prodrugs (P>0.1), whereas the infected LS174T cells failed to exhibit similar sensitivity (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either suicide gene (P<0.001). The cell cycle of LoVo cells was arrested at G1 phase. CONCLUSION: The CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter can selectively kill KDR-expressing human colorectal cancer LoVo cells and endothelial cells.     

KDR启动子驱动的双自杀基因对人结肠癌细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人结肠癌细胞SW480的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的SW480细胞和不表达KDR的LS174T细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应;用流式细胞术观察细胞内DNA含量和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW480和LS174T细胞中有GFP表达。RT-PCR检测发现SW480细胞有目的基因的表达,而LS174T细胞无表达。在前药应用下,已转染腺病毒的SW480和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW480细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应。用流式细胞仪测定给药组出现典型的凋亡峰,细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞...     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinase domain-containing receptor,KDR) 启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和／或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果所得病毒滴度为2．0×1012pfu／ml。MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0．001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0．001)。同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变。结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞。     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

目的 探讨血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动重组腺病毒CDglyTK融合基因体系对结直肠癌细胞株LOVO及人脐血管内皮细胞株ECV30的选择性杀伤作用.方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的LoVo、ECV30细胞和对照组不表达KDR的LS17T细胞,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对细胞株的杀伤效应.结果 制备的病毒滴度为2.0×1012pfu/ml.3种细胞的感染率相似,且感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均接近100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株,发现其对前药的敏感性不同:表达KDR的LoVo和ECV30细胞对前药具有较高的敏感性,且二者敏感性无显著差异(P>0.1);与前二者相比,LS17T细胞对前药不敏感(P<0.001).同时,CDglyTK双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001).流式细胞术检测表明该体系抑制LoVo细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P<0.001).结论 KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤结直肠癌LoVo细胞和血管内皮细胞.