人原代胶质瘤细胞自杀基因治疗体外研究

目的：应用原代培养的胶质瘤细胞作不研究对象,观察ＡＣＶ对转染了ＨＳＶ－ｔｋ基因的肿瘤细胞的杀伤作用。方法：表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）重组逆转录病毒载体ＳＴＫ,经包装细胞ＰＡ３１７包装成重组逆转录病毒,ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,用此病毒感染原代培养的人胶质瘤细胞,以Ｇ４１８选择后获得ＴＫ＋肿瘤细胞。ＭＴＴ法及活细胞动态观察ＡＣＶ对转基因细胞的毒性作用。结果：ＡＣＶ对ｔｋ＋胶质瘤细胞     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体内实验研究

目的 观察CDgtyTK双自杀基因对C6实体胶质瘤生长的抑制作用. 方法 利用逆转录病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)融合基因转染小鼠C6实体胶质瘤,RT-PCR检测分析融合基因的表达,并观察对照组和治疗组肿瘤体积、重量、抑瘤牢及生存期的变化,同时观察其对C6胶质瘤细胞凋亡的影响,分析CDglyTK双自杀基因系统对肿瘤的抑制作用. 结果 RT-PCR检测显示逆转录病毒介导的COgtyTK双自杀基因在C6胶质瘤中有表达.对照组第4周肿瘤已长至20 mmx30 mm大小.并出现小鼠死亡现象,至第6周末全部死亡;治疗组肿瘤体积未增长,约5 mm大小.部分肿瘤消失.肉眼观察可见对照组肿瘤体积大,色红,血供丰富,治疗组肿瘤体积减小或消失.21 d后处死取瘤称重,对照组[(2.51±0.58)g]与治疗组肿瘤质量[(0.35±0.26)g]比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗组抑瘤牢为86.1%.流式细胞仪检测可见治疗组细胞凋亡率(34.41%±5.20%)明显高于对照组(2.92%±1.30%),差异有统计学意义(P<0.05).电镜观察可见治疗组肿瘤细胞凋亡小体形成. 结论 效 CDglyTK双自杀基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用.     

突变型胸苷激酶对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应

目的 观察比较突变型单纯疱疹胸苷激酶(HSV1-sr39tk)/更昔洛韦(GCV)和野生型HSV1-tk/GCV对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应.方法 利用真核表达载体转染目的 基因到C6细胞,RT-PCR鉴定.通过MTT实验和活体植瘤,比较各组对GCV敏感性.结果 成功获得分别转染有HSV1-tk(C6/tk)和HSV1-sr39tk(C6/sr39tk)、的C6细胞.GCV浓度在0～400μmol/L时,C6/sr39tk细胞存活率由(99.96±3.54)%下降到(4.75±1.79)%;C6/tk细胞存活率从(100.03±2.95)%降至(59.16±3.48)%,未转染组细胞存活率则从(100.29±1.20)%到(83.62±7.56)%.同一GCV浓度时,各组间细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05).各组细胞在活体均能致瘤,GCV治疗10 d后,C6、C6/tk和C6/sr39tk组肿瘤大小分别为(1287.24±364.84)mm3、(928.47±165.61)mm3和(574.08±107.72)mm3,较治疗前均有一定程度的生长,但后两组生长较前组明显减缓,以C6/sr39tk组生长减缓最明显.组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 体外和体内实验证实HSV1-sr39tk比HSV1-tk对GCV更敏感,可提高其与GCV所组成的自杀基因系统对C6胶质瘤细胞的杀伤效应.     

人外周血内皮祖细胞转染自杀基因杀伤恶性胶质瘤细胞的体外研究

目的观察5-氟胞嘧啶诱导基因修饰型内皮祖细胞群发生自身死亡及其旁效应对共培养人脑胶质瘤细胞系U251的杀伤作用。方法采用密度梯度离心法分离经体外诱导培养的人外周血内皮祖细胞,经转染获得基因修饰型内皮祖细胞。RT-PCR法鉴定胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在基因修饰型内皮祖细胞中的表达变化,观察野生型和基因修饰型内皮祖细胞在不同浓度5-氟胞嘧啶作用下的细胞存活率,以及基因修饰型内皮祖细胞所诱导的旁效应。结果真核细胞表达载体pCEA-CD-CAUP转染成功,CD基因在基因修饰型内皮祖细胞中表达阳性;在不同浓度5-氟胞嘧啶(0.01～1000.00μg/ml)作用下,基因修饰型内皮祖细胞存活率低于野生型内皮祖细胞,组间差异有统计学意义(均P<0.05)。不同比例的基因修饰型内皮祖细胞与人脑胶质瘤细胞系U251共培养72h后,其细胞生长抑制率均高于基因修饰型内皮祖细胞所占的比例,当基因修饰型内皮祖细胞比例占细胞总数的50%时,细胞生长抑制率即已>80%。结论人外周血内皮祖细胞转染CD基因后,在5-氟胞嘧啶的作用下可发生自身死亡并触发旁效应而杀伤共培养的人脑胶质瘤细胞系U251细胞,为抗血管生成药物与自杀基因联合应用治疗恶性胶质瘤的体内实验及后续研究提供了依据。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶（CD）自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。方法采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞，G418筛选阳性克隆（U251-CD），采用RT—PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪（FCM）凋亡分析和高效液相色谱（HPLC）等方法检测CD基因的表达及其功能。结果CD基因成功转染U251细胞。G418筛选获得阳性克隆．RT—PCR证实阳性细胞有CD基因表达，抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性．U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶（5-FC）后，FCM显示细胞凋亡峰，HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶（5-FU）产生。结论CD基因能够在U251细胞表达．并具备将5—Fc转变为5-Fu的功能，造成肿瘤细胞凋亡．CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一。     

逆转录病毒载体介导中国单疱病毒TK基因转导脑胶质瘤细胞

目的：研究载中国单疱病毒胸苷激酶基因逆转录病毒重组体（ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ）和羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）体外转染和杀伤脑胶质瘤效果，探索应用该系统基因治疗脑胶质瘤。方法：ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ重组体病毒感染胶质瘤细胞，Ｇ４１８筛选转染阳性胶质瘤细胞克隆。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测抗Ｇ４１８胶质瘤细胞中的ＴＫｃ基因表达。药物敏感实验观察ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的毒性反应。结果：１．０ｍｇ／ｍｌＧ４１８筛选１０～１４天获抗性胶质瘤细胞克隆；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示抗Ｇ４１８细胞ＴＫｃ基因明显表达；ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ高度敏感，其ＥＤ５０为：Ｃ６ＴＫｃ０．０２μｇ／ｍｌ，Ｕ２５１ＴＫｃ０．００６μｇ／ｍｌ，Ｕ８７ＴＫｃ０．００４μｇ／ｍｌ，ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的敏感性是非转基因胶质瘤细胞的５００倍以上。结论：载中国ＴＫｃ基因逆转录病毒重组体可有效转染脑胶质瘤细胞并使其对ＧＣＶ高度敏感，该系统可望用于脑胶质瘤的基因治疗。     

慢病毒在大鼠胶质瘤细胞基因转导中的应用

目的应用慢病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。方法构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-TK并以PCR、酶切及测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统,将重组质粒与包装混合物（Packaging Mix）共同转染293T细胞生产假病毒颗粒,转染48 h后收集培养上清,用其感染大鼠9L胶质瘤细胞,以抗稻瘟菌素（BSD）筛选出9L-TK细胞。RT-PCR、Western blot方法检测TK基因在9L-TK细胞中的表达。用MTT方法测试更昔洛韦（GCV）对体外培养的9L-TK细胞杀伤效果。结果构建的重组质粒pLenti6/V5-TK经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×10^5转导单位（TU）/ml。经BDS筛选获得的9L-TK细胞RT-PCR及Western blot结果显示TK基因表达阳性,且GCV对该细胞作用敏感。结论成功利用慢病毒实现了TK基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。     

姜黄素对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因下调作用的体外研究

目的 探讨姜黄素对体外培养胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因(PTTG)表达的影响.方法 体外培养胶质瘤C6细胞,给予不同浓度的姜黄素(10μmol/L、20 μmol/L、30μmol/L)作用24h后应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PTTG mKNA表达情况,Western blot方法 检测PTTG蛋白水平的变化. 结果 姜黄素作用后,C6细胞PTTG mRNA表达与PTTG蛋白水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01),且随着浓度的增加,其下降越明显. 结论 姜黄素具有下调胶质瘤C6细胞PTTG表达的作用,并呈剂量依赖性.     

反转录病毒介导的HSV-tk基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的：进行Ｃ６大鼠脑胶质瘤的基因治疗实验研究。方法：采用反转录病毒介导的基因转移和ＡＣＶ体内治疗方法进行研究。结果：构建了带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ，应用脂质体转移方法将ＧＩＮａＴＫ导入反转录病毒包装细胞ＰＡ３１７，成为产病毒细胞ＰＡ３１７ＴＫ，用带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的复制缺陷型反转录病毒感染Ｃ６细胞，命名为Ｃ６ＴＫ细胞，对ＧＣＶ和ＡＣＶ的敏感性分别高于亲本４５０倍和１０倍；成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型，并证实转染细胞Ｃ６ＴＫ的成瘤效应未改变，存活期约为１５天；而经ＡＣＶ治疗后，含有Ｃ６ＴＫ细胞的肿瘤生长明显被抑制，大鼠生存期延长为５７．８±８．０７天，尤其是采用ＰＡ３１７ＴＫ细胞混和治疗组和原位治疗组，肿瘤基本消失，大鼠生存期显著延长，混和治疗组存活１２０天以上，原位治疗组存活至７１．４±３６．１天。ｔ检验，Ｐ值均小于０．００１。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗大鼠脑胶质瘤疗效显著。     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

腺病毒介导的HSV—tk基因治疗大鼠脑胶质瘤实验研究

目的：带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组腺病毒（ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ）结合核苷类似物（ＮＡ）治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法：用Ｘ－ｇａｌ染色测定ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ转染大鼠Ｃ６胶质瘤细胞的效率。用ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ、ＧＣＶ离体及活体治疗大鼠Ｃ６胶质瘤。结果：ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ感染Ｃ６细胞效率达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ感染Ｃ６细胞，在病毒感染复数为１０００时，ＧＣＶ和ＡＣＶ半致死剂量分别为３μｇ／ｍｌ和２０μｇ／ｍｌ，Ａｄ－ＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ治疗大鼠Ｃ６胶质瘤模型，大鼠生存期超过９０天，而对照组分别为１７．０±１．６天（生理盐水组）、１４．５±１．３天（ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ组），Ｐ＜０．００１。结论：重组腺病毒对靶细胞感染效率可达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ用ＧＣＶ的杀伤Ｃ６胶质瘤细胞比ＡＣＶ强，而ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ用腺病毒介导治疗大鼠脑肿瘤疗效显著。     

Adenovirus‐mediated suicide gene therapy in an in vitro model of reactive gliosis

Adenovirus‐mediated herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir (HSV‐tk/GCV) system has been demonstrated to be efficient for the treatment of experimental brain tumors. However, no study has been directed to the elimination of proliferating cellular populations in other pathological conditions. In this study we used this suicide gene approach in a primary culture of astrocytes, as a model of reactive gliosis, in order to evaluate its efficiency as a therapeutic strategy for post‐traumatic astrogliosis in vivo. First, we evaluated the peak of astrocytic proliferation to characterize our model. Second, the efficiency of adenovirus‐mediated lacZ gene transfer is shown to be dependent on vector multiplicity of infection (MOI). As expected, the cells transfected with the HSV‐tk gene showed an increase in sensibility to GCV compared with cells transfected with lacZ gene. Finally, an unexpected interaction between the adenoviral vector and bromodeoxyuridine (BrdU) or [³H]‐Thymidine ([³H]‐Thy) was evidenced in transfected cultures, whose interpretation is discussed. The present study demonstrates that a recombinant adenoviral vector carrying the tk gene confers to in vitro cultured astrocytes a cytotoxic sensibility to GCV, and that this system constitutes a potentially efficient tool to eliminate the hyperplasia of astrocytes following injury to the central nervous system in vivo. GLIA 25:293–303, 1999. © 1999 Wiley‐Liss, Inc.     

wt-p53基因联合HSV-TK/GCV对C6鼠胶质瘤杀伤作用的实验研究

目的研究wtp53基因联合自杀基因治疗恶性胶质瘤的可行性。方法体外试验以腺病毒为载体转导wtp53和HSVTK入C6鼠胶质瘤细胞,给以不同浓度的GCV,以MTT法检测细胞生存率。体内实验以C6鼠胶质瘤细胞和SD大鼠建立动物模型,原位注射腺病毒为载体的wtp53和HSVTK基因,腹腔给以GCV(15mg.kg-1day-1×14)。观察荷瘤鼠生存期;强化MRI动态监测荷瘤鼠肿瘤大小;TUNEL法检测凋亡。结果wtp53基因明显提高鼠胶质瘤细胞对HSVTK/GCV的敏感性,p53联合HSVTK基因转染C6的GCVID100=0.01μg.ml-1,而单独HSVTK转染C6的GCVID100=1μg.ml-1,约提高100倍;p53基因还可使C6细胞凋亡增加。体内p53基因联合HSVTK/GCV治疗使荷瘤鼠生存期明显延长,凋亡明显增加(P<0.001);强化MRI示4周肿瘤消失。结论p53基因和HSVTK基因的联合基因治疗可作为临床上优化自杀基因治疗方案的一种可能选择。     

Adenovirus-mediated gene therapy of experimental gliomas

The efficacy of adenovirus (ADV)-mediated gene therapy to treat brain tumors was tested in a syngeneic glioma model. Tumor cells were transduced in situ with a replication-defective ADV carrying the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene controlled by the Rous sarcoma virus promoter. Expression of the HSV-tk gene enables the transduced cell to convert the drug ganciclovir to a form that is cytotoxic to dividing cells. Tumors were generated in Fischer 344 rats by stereotaxic implantation of 9L gliosarcoma cells into the caudate nucleus. Eight days later, the tumors were injected either with the ADV carrying the HSV-tk (ADV-tk) gene or a control ADV vector containing the β-galactosidase (ADV-βgal) gene and the rats were treated with either ganciclovir or saline. Tumor size was measured 20 days after implantation of 9L cells or at death. Rats treated with ADV-βgal and ganciclovir or with ADV-tk and saline had large tumors. No tumors were detected in animals treated with ADV-tk and with ganciclovir at doses ≥80mg/kg. An infiltrate of macrophages and lymphocytes at the injection site in animals treated with ADV-tk and ganciclovir indicated an active local immune reaction. In survival studies, all animals treated with ADV-tk and ganciclovir have remained alive longer than 80 and up to 120 days after tumor induction whereas all untreated animals died by 22 days. These results demonstrate that ADV-mediated transfer of HSV-tk to glioma cells in vivo confers sensitivity to ganciclovir, and represents a potential method of treatment of brain tumors. © 1994 Wiley-Liss, Inc.     

Cx43基因提高自杀基因治疗恶性胶质瘤疗效的实验研究

目的探讨连接蛋白43（Cx43）基因联合自杀基因提高恶性胶质瘤治疗疗效的可行性。方法体外实验以脂质体介导Cx43和腺病毒介导HSV—tk基因转染入C6鼠胶质瘤细胞．给以不同浓度的更昔洛韦（GCV），以MTT法检测细胞生存率。体内实验以C6鼠胶质瘤细胞和SD大鼠建立动物模型，原位注射Cx43和HSV—tk基因．腹腔给以GCV．观察荷瘤鼠生存期；强化MRI动态监测荷瘤鼠肿瘤大小；采用原位杂交方法检测Cx43和HSV—tk基因的表达：TUNEL法检测细胞凋亡。结果Cx43基因在体内、外均明显提高HSV—tk／GCV对胶质瘤的疗效。当伙基因转导的细胞约占50％时，Cx43基因联合HSV—tk基因转染C6的GCV ID50和ID100均较单独HSV—tk转染的降低10倍。体内Cx43基因联合HSV—tk／GCV治疗使荷瘤鼠生存期显著延长（P〈0．001），凋亡明显增加，其中3只荷瘤鼠的强化MRI示肿瘤于8周消失。结论Cx43基因和HSV—tk基因联合基因治疗可作为临床上胶质瘤联合基因治疗方案的一种优化组合。