RACK1对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 探讨激活性蛋白激酶C受体1（RACK1）对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在的机制。方法 收集2020年12月-2021年12月新疆医科大学第一附属医院24例患者的宫颈鳞癌（CSCC）组织及24例无宫颈病变的正常宫颈（NC）组织,采用qRT-PCR检测CSCC和NC组织中_RACK1 mRNA的表达水平,并检测CSCC组织中增殖和凋亡相关基因_c-myc、_caspase-3、_caspase-9、_Bax、_Bcl-2 mRNA的表达水平;采用Spearman秩相关分析CSCC组织中_RACK1 mRNA与增殖和凋亡相关基因mRNA表达的相关性。采用qRT-PCR及Western blotting检测RACK1在宫颈癌细胞C33a、SiHa和正常宫颈内皮细胞H8中的表达情况。通过慢病毒转染C33a、SiHa细胞以沉默RACK1的表达,根据不同处理分为正常对照组（NC）、空载组（sh-NON）和沉默组1（shRACK1-1）、沉默组2（sh...     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡及其机制

目的研究去乙酰化酶转移酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人胃癌细胞SGC-7901的凋亡诱导作用及其机制。方法利用细胞计数、流式细胞仪及末端脱氧核苷酸转移酶生物素dUTP切口末端标记法(TUNEL)研究TSA对胃癌细胞SGC-7901的凋亡诱导作用。利用蛋白印迹法、基因芯片及实时定量PCR研究TSA对胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响。结果TSA可诱导胃癌细胞SGC-7901发生凋亡;TSA可增加胃癌细胞SGC-7901p53,bax等基因的表达,降低BCL-2、生存素和半胱天冬酶的表达;TSA可使凋亡诱导因子抗侵袭因子(AIF)和核酸内切酶EndoG从线粒体释放并转移到细胞核内;TSA可通过调控多个凋亡相关基因的表达诱导胃癌细胞发生凋亡,且该凋亡是半胱天冬酶非依赖性的。结论TSA可通过调控多个凋亡相关基因来实现其诱导胃癌细胞凋亡的作用,这种凋亡诱导作用是通过半胱天冬酶非依赖途径进行的。     

DNMTI siRNA 对人胰腺癌 PaTu8988 细胞周期的调控机制研究

目的 研究沉默DNA甲基转移酶1(DNMTI)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和细胞周期的影响及可能机制.方法 培养的人胰腺癌PaTu8988细胞分为空白对照组、阴性 siRNA(15nmol/L)组、阴性siRNA(30nmol/L)组、DNMT1 siRNA(15nmol/L)组和DNMT1 siRNA(30nmol/L)组.转染48h后,采用real-time PCR和Western blotting 评价沉默效率和细胞周期调控基因p21的表达情况;WST-8法榆测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期变化.结果 转染48h后,15nmol/L和30nmol/L 浓度的DN-MT1 siRNA均明显抑制了DNMT1 mRNA和蛋白的表达DNMT1 siRNA转染后人胰腺癌PaTu8988细胞增殖受抑制,各组细胞增殖抑制率依次为0%±12.0%、13.7%±8.2%、23.4%±7.3%、17.1%±5.8%和36.9%±14.2%,其中DNMT1 siRNA(30nmol/L)组的细胞增殖抑制率明显高于其他各组(P<0.01);DNMT1 siRNA(15nmol/L)组和DNMT1 siRNA(30nmol/L)组的G2/M期细胞百分率均显著低于其他各组,S期细胞百分率明显高于其他各组(P<0.05);DNMT1 sLRNA(30nmol/L)组细胞周期调控基因p21 mRNA相对表达量明显高于其他各组(P<0.01).结论 DNMT1 siRNA能特异性抑制胰腺癌细胞DNMT1的表达,并抑制细胞增殖、促使细胞出现S期阻滞,其机制可能与上调细胞周期凋控基因p21的表达有关.     

HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

目的研究HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。方法构建靶向HIP1的shRNA表达载体pSilence-shHIP1,应用脂质体转染到PC-3细胞,RT-PCR检测HIP1基因沉默效果,Western blotting确认有效作用靶点。通过细胞划痕实验和细胞生长曲线研究HIP1基因对PC-3细胞增殖的影响。结果转染PC-3细胞后,沉默HIP1基因效率达83%(P<0.01);Western blotting证实该基因片段为抑制HIP1的有效作用靶点。细胞划痕实验和生长曲线显示HIP1基因沉默可抑制PC-3细胞的增殖。结论 pSilence-shHIP1表达载体可特异性地抑制HIP1基因的表达,沉默HIP1基因可抑制PC-3细胞增殖和迁移。     

慢病毒介导的RNA干扰对鼻咽癌细胞株中转移相关基因1的沉默效应

目的 评价鼻咽癌细胞株SUNE1的两个不同转移潜能亚株5-8F和6-10B中转移相关基因1(MTA1)表达的差异,以及慢病毒介导的RNA干扰技术对人鼻咽癌高转移潜能细胞株5-8F中MTA1的沉默效应.方法 采用RT-PCR和Western blotting检测5-8F和6-10B细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达的差异.利用在线数据库和软件设计MTA1 siRNA片段,构建特异性MTA1的慢病毒干扰载体,转染鼻咽癌细胞5-8F,荧光定量PCR和Western blotting检测其MTA1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 5-8F细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达均高于6-10B细胞.经测序分析,插入片段正确;荧光定量PCR 和 Western blotting 检测显示,RNA干扰后MTA1的表达水平明显降低.结论 MTA1可能在促进鼻咽癌细胞株的恶性转化和转移潜能的增强中具有作用.MTA1 siRNA可高效、特异地抑制5-8F细胞MTA1表达,为研究MTA1基因在鼻咽癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具.     

RNA干扰对肾癌细胞系MDR1基因表达的抑制

1 方法 1.1 siRNA的设计和合成根据多药耐药基因1(MDR1)已知序列(NM 000927),设计3条sLRNA序列(分别为siRNAl、mR-NA2、siRNA3),另设随机序列作为阴性对照,根据每条siRNA序列构建对应的DNA模板单链,模板链两端分别添加BamH Ⅰ和EcaR Ⅰ酶切位点.     

shRNA干扰沉默Net1基因对电离辐射损伤反应的影响

目的 研究神经上皮细胞转化基因1（NET1）在电离辐射损伤反应中的生物学功能。 方法 运用RNA干扰技术,在细胞中特异性沉默Net1基因,然后通过集落存活实验和免疫印迹法研究抑制Net1表达对细胞的电离辐射损伤反应的影响。 结果 Net1敲低表达的细胞对电离辐射的敏感性增强,表现为更多细胞发生了凋亡,并且在γ射线照射后,毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ATM）和细胞周期检查点激酶2（Chk2）的磷酸化水平也比对照细胞增强。 结论 Net1对于受到电离辐射的细胞有一定的保护作用,很可能在电离辐射损伤修复中具有重要作用。     

iASPP干扰RNA转染HepG-2细胞后细胞凋亡的变化

目的:观察iASPP基因干扰RNA转染肝癌细胞HepG-2后的干扰效果及细胞凋亡的变化.方法:设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTM H1/Neo/GFP质粒中,用脂质体将重组子转染至HepG-2细胞中,用RT-PCR方法检测iASPP表达的变化,Western blot检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:iASPP干扰质粒转染HepG-2细胞后,iASPP表达下降,凋亡细胞增加.结论:抑制内源性的iASPP,能有效地恢复肝癌细胞HepG-2中p53的抑癌功能.     

Oct4基因沉默对结直肠癌细胞凋亡的诱导作用及机制研究

目的 探讨Oct4基因沉默对人结直肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能机制.方法 将对数生长期SW480细胞分为3组.①空白对照(Con)组:不转染病毒;②阴性对照(NC)组:转染阴性对照病毒;③RNA干扰(RNAi)组:转染Oct4-shRNA慢病毒载体.采用实时荧光定量PCR检测Oct4 mRNA表达;采用Western blotting检测Oct4、p-Akt 蛋白表达;采用流式细胞仪测定Oct4+及CD44+细胞比例变化及肿瘤细胞凋亡情况.结果 与NC组比较,RNAi组Oct4 的mRNA(分别为1.00和0.19±0.02)和蛋白(分别为0.032±0.004和0.007±0.001)表达量均有明显下降(P＜0.0l),Oct4+细胞比例(分别为91.53％和10.70％)和CD44+细胞比例(分别为59.69％和23.58％)明显减少,p-Akt蛋白表达明显受抑(0.11+0.03和0.03±0.01),细胞凋亡明显增加(分别为l2.1％±1.8％和43.2％±4.5％,P＜0.01).结论 沉默Oct4基因可明显减少SW480细胞中Oct4+及CD44+细胞比例,增加细胞凋亡,其作用可能与PI3K/Akt通路有关.     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

多烯紫杉醇对人胆管癌细胞和胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的评价多烯紫杉醇对人胆管癌细胞HCCC-9810和胰腺癌细胞BXPC-3的增殖和凋亡影响,为药物涂层支架治疗恶性梗阻性黄疸的应用提供实验基础。方法应用四硝基偶氮唑蓝法测定紫杉醇对人胆管癌细胞HCCC-9810和胰腺癌细胞BXPC-3增殖的抑制作用,Hoechst染色法检测诱导细胞凋亡。结果多烯紫杉醇可明显抑制2种肿瘤细胞株的增殖,且该抑制效应随药物剂量的增加和作用时间的延长而增强（HCCC：χ^2=24.42,P〈0.01 BXPC-3：χ^2=24.68,P〈0.01）,根据增殖曲线和统计学分析,选取0.4mg/L为多烯紫杉醇最适实验浓度。凋亡分析实验显示多烯紫杉醇可诱导2种肿瘤细胞株的凋亡（HCCC：χ^2=30.05,P〈0.01 BXPC-3：χ^2=25.22,P〈0.01）。结论多烯紫杉醇有抑制BXPC-3和HCCC-9810的增殖并诱导肿瘤细胞凋亡的作用。     

上调microRNA-150表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨上调microRNA- 150 (miR- 150)表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 SMMC7721细胞分成miR-150感染组(加入pGIPZ-miR-150慢病毒表达载体)、阴性对照组(加入只含GFP的慢病毒载体)和空白对照组(不转染).采用荧光定量PCR检测miR-150的表达情况,Western blotting检测靶基因c-Myb蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 荧光定量PCR结果显示,转染miR-150pGIPZ后,SMMC7721细胞miR-150表达量(2.48±0.15)较阴性对照组(0.81±0.09)增加了2倍(p＜0.01).CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组比较,miR-150组的细胞增殖率显著降低(P＜0.05).Western blotting检测结果表明,miR-150组细胞c-Myb蛋白表达(0.31±0.07)与空白对照组(0.80±0.09)及阴性对照组(0.81±0.08)相比明显减少(P＜0.0l).流式细胞仪检测结果显示,miR-150组细胞凋亡率(19.36％±1.78％)与阴性对照组(5.12％±0.54％)及空白对照组(4.68％±0.35％)相比明显增加(P＜0.01).结论 上调miR-150表达可通过降低靶基因c-Myb的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,miR-150可能成为肝癌靶向治疗新的靶基因.     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

RNA干扰肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因对放射敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)N-Ras基因增强人肝癌MHCC-97细胞的放射敏感性.方法 通过构建干扰N-Ras基因siRNA,采用免疫组织化学法、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、MTT法观察RNAi前后肝癌MHCC97-H细胞RNA水平、蛋白水平、生长情况等变化,照射后用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化.结果 MHCC97-H细胞株RNAi后mRNA表达抑制率为96.9%±0.159%,RNAi前后差异有统计学意义(t=40.377,P＜0.05),蛋白表达抑制率为89.8%±0.012%,RNAi前后差异有统计学意义(t=31.595,P＜0.05),免疫组织化学显示90%表达被抑制,细胞生长抑制率为21.9%,RNAi前后差异均有统计学意义(F=4.63,P＜0.05).MHCC97.H细胞RNAi后增敏比(SER)=1.15.结论 RNAi肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因可以达到放射增敏的目的.

Abstract：

Objective To investigate the radiosensitivity of silencing N-Ras by RNA interference in hepatoma carcinoma cell MHCC-97.Methods N-Ras RNA interference (RNAi) vector was constructed by using pcDNA 6.2-GW/EmGFP-mir plamid.The RNAi effect was detected by RT-PCR,Western bolt,immunohistochemisty and MTT method.Survival curve for each cell line were obtained by measuring the clone forming abilities of irradiated cell populations.Results After silencing the N-Ras by RNAi,The expression level of N-Ras mRNA,N-Ras protein,immunohistochemisty were decreased 96.9% ±0.159%(t=40.377,P＜0.05),89.8%±0.012% (t=31.595,P＜0.05),90%,respectively,and The survival of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line were inhibited 21.9% (F = 4.63,P < 0.05).Which have significant difference in statistics.The SER of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line after interference was 1.15.Conclusions RNAi targeting silence N-Ras may increase the radiosensitivity of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line.     

A549肿瘤细胞中特异性hTERT-siRNA的干扰作用研究

目的 研究hTERT特异的siRNA对肿瘤细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。方法 设计和构建由U6启动子驱动的产生特异hTERT的siRNA表达质粒,转染至A549肺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,Western blot检测端粒酶蛋白的表达,MTT法检测对细胞生长的影响。结果 构建的针对hTERT基因745靶位点的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的A549肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论 应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。     

RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达

目的：通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达，从而部分恢复抑癌基因的表达。方法：采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性。应用体外转录的方法，共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列，并转染人肺癌细胞NCI-H157。采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析，半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达。结果与结论：5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达，且呈剂量依赖效应。人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化，在抑制DNMT1活性后，RASSF1A基因去甲基化而恢复表达。     

干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、周期及凋亡的影响

 目的 探讨干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 选择FoxM1高表达食管癌细胞株,构建FoxM1-shRNA干扰质粒转染食管癌细胞,观察干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果 成功转染后细胞中FoxM1蛋白水平表达明显降低(t=13.17, P<0.01),细胞增殖明显受抑并呈时间依赖性,72 h抑制效果最显著(68.0%±6.4%,P<0.05);干预组细胞增殖周期发生G₁期阻滞(59.14%±1.69% vs 40.51%±1.45%,t=14.23,P<0.01)、细胞凋亡增加(2.48%±0.49% vs 35.37%±0.56%,t=76.56,P<0.01)。结论 干预FoxM1表达使细胞周期发生G1期阻滞并能促进细胞凋亡,从而抑制TE1细胞增殖,FoxM1可能是食管癌基因治疗潜在的有效靶点。     

STAT3 siRNA引起U251细胞凋亡的研究

目的:观察利用siRNA技术下调人脑胶质母细胞瘤细胞(U251)STAT3表达后对细胞凋亡的影响. 方法:分离培养并间接免疫荧光鉴定大鼠原代星形胶质细胞(NA),用STAT3干涉质粒载体(pSilence2.1-STAT3)及对照载体(pSilence2.1-GFP)转染U251细胞及NA细胞,用Hoechst 33258染色观察凋亡的形态学改变,用Annexin-V试剂盒定量检测凋亡.结果:分离培养了符合实验要求的NA细胞,转染pSilence2.1-STAT3后,U251细胞出现了明显的时间依赖性细胞凋亡,而NA细胞无显著凋亡发生.结论:pSilence2.1-STAT3能诱导U251细胞凋亡,而对正常细胞无显著影响.