大鼠肾HGPRT mRNA降解与死亡时间关系的研究

〗目的:探讨大鼠死后肾次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系。方法:40只Wistar大鼠断颈处死,置于20℃温控系统内,利用一步法荧光标记RT-PCR技术检测大鼠肾管家基因HGPRTmRNA在死后即刻至36 h降解情况。结果:在死后即刻至32 h大鼠肾组织均可检测到HGPRTmR-NA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。结论:大鼠死亡后肾HGPRTmRNA降解与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标。     

荧光标记RT-PCR技术在实验动物死亡时间推断中的应用

目的 探讨荧光标记逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)在死亡时间(PMI)推断中的应用.方法 44只大鼠断颈处死后置于20℃温度控制系统内,利用荧光标记RT-PCR技术检测大鼠脑及肝组织GAPDH mRNA在死后即刻至8 d的相对表达量的变化.结果 在大鼠死后即刻至7 d脑组织、2 d肝组织内均可检测到GAPDH mRNA,其扩增产物的降解呈现出一定的规律性.结论 荧光RT-PCR技术检测大鼠死后脑及肝GAPDH mRNA,可为PMI推断提供一种新的方法.     

小白鼠死后脾组织RNA降解程度与死亡时间关系的研究

目的探讨小白鼠死后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系。方法 48只NIH小白鼠安乐死处死,分别置于10℃和25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA方法检测小白鼠脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA在死后即刻至72h降解情况。结果在10℃温控系统内的小白鼠死后即刻至72h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。25℃温控系统内的小白鼠死后即刻至48h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。结论小白鼠死亡后脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标。     

死后脾组织mRNA降解程度与死亡时间的关系

目的 探讨小白鼠死后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系.方法 24只NIH小白鼠断颈处死,置于25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA方法检测小白鼠脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA在死后即刻至72 h降解情况.结果 在25℃温控系统内的小白鼠死后即刻至48 h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势.结论 小白鼠死亡后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解程度与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标.     

大鼠死后心肌肌红蛋白mRNA的含量变化与死亡时间的相关性研究

目的:研究大鼠心肌肌红蛋白(Myoglobin,Mb)mRNA 的降解规律,探讨其与死亡时间(Postmonem interval,PMI)的关系.方法:在25℃±1 ℃,65%～70%温度控制系统下,通过采用RT-PCR技术检测大鼠死后心肌Mb mRNA在体保存和离体保存条件下各相应时间段的含量变化,用SPSS 17.0软件对数据进行分析.结果:大鼠死后心肌Mb mRNA随死亡(离体)时间延长而逐渐降低,且与死亡(离体)时间呈线性关系,但在体保存要比离体保存降解慢.结论:Mb mRNA的降解呈时间相关性,在体与离体条件下的降解规律并不完全一致;Mb mRNA有望用于推断较早期死后经过时间.     

大鼠死后脑组织GAPDH mRNA多位点降解与晚期死亡时间的关系研究

目的 探讨看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) mRNA上不同位点降解速率的规律性及其用于晚期死亡时间推断的可行性.方法 选取在死后较长时间内仍能检测出扩增产物的大鼠脑顶叶皮质,对GAPDH mRNA的6个不同位点进行不同时间点(死后即刻、1 d、5 d、9 d、12 d)的实时荧光定量RT-PCR监测,这些位点依次分布于GAPDH mRNA的5′～ 3′端.结果 用Ct值表示,并将所得数据及其比值(GAPDH mRNA 1～GAPDH mRNA 5与GAPDH mRNA 6的比值)与死亡时间(PMI)进行线性回归分析. 结果各位点GAPDH mRNA均与死后经过时间有相关性,但不同位点的mRNA降解速率不同.GAPDH mRNA 1～GAPDH mRNA 3的斜率为1.577、1.596、1.553,这3个位点的降解速率基本相同.GAPDH mRNA 4～GAPDH mRNA 6的斜率为0.936、0.892、0.829,这3个位点的降解速率基本相同.但后3个位点mRNA的降解速率要慢于前3个位点(P<0 05).以GAPDH mRNA 6作为外标,GAPDH mRNA 1～GAPDH mRNA 3与其的比值同PMI之间有相关性(R2=0 898,0 871,0 879),而GAPDH mRNA 4和GAPDH mRNA 5与其的比值同PMI之间无相关性.结论 同一组织中看家基因GAPDH的不同位点存在降解速率的差异性.选取降解速率慢的靠近3′端的位点作为引物,可能更适于研究晚期死亡时间的推断.     

实时RT-PCR定量检测NGF mRNA表达水平方法的建立

目的:建立一种用SYBR GreenⅠ实时定量逆转录(SYBR GreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA,利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGF mRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF mRNA检测的特异性,以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGF mRNA SYBR GreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGF mRNA基因表达的方法。     

家兔玻璃体液AKPγ—GT活性变化与PMI的相关性

目的研究死后家兔玻璃体碱性磷酸酶（AKP）和γ一谷氨酰转肽酶（γ一GT）活性与死后经过时间（PMI）的相关性,寻找一种推断PMI的新方法。方法应用酶动力学比色法检测在25~30℃和10~15℃下死后即刻至54h之间玻璃体液AKP和γ一GT活性变化情况。结果从死后即刻至54h之间发现,死后一定时间内,两种酶活性降解均存在平台期,平台期后AKP、γ一GT活性迅速下降,并逐步降解趋于零。经统计学分析,家兔死后两种酶活性与PMI之间有显著的负相关性（P〈0．01）。结论在0h~54h内两种酶活性的降解规律可作为推断PMI的参考指标。     

大鼠离体肝脏5′-NT和ACP活性与PMI的相关性研究

目的:探讨大鼠死后肝脏内5′-核苷酸酶(5-′Nu-cleotidase,下称5-′NT)和酸性磷酸酶(Acid phosphatase,下称ACP)活性变化与死后经过时间(Postmortem interval,PMI)的相关性。方法:应用分光光度法检测18℃和28℃下大鼠死后肝脏5-′NT和ACP的活性。结果:大鼠死后0~21 h,其肝脏内5-′NT由150 IU/L逐渐降至0,且与时间呈明显的负相关,回归方程为:PMI=23.18-0.774X5-′NT(r=-0.882,P<0.01);而ACP与时间无明显相关性。结论:5′-NT的降解规律可作为推断PMI的参考指标。     

小白鼠死后肾组织RNA降解程度与死亡时间的关系

目的 探讨小白鼠死后肾组织管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA和内源性对照β-肌动蛋白(β-actin)mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系.方法 48只美国国立卫生研究院小白鼠断颈处死,分别置于10℃和25℃温控系统内,利用两步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA...     

丹酚酸B对小鼠日本血吸虫病肝纤维化MMP-1、TIMP-1的影响

目的:探讨丹酚酸B治疗小鼠血吸虫病肝纤维化,血清MMP-1与TIMP-1的变化及肝组织MMP-2与TIMP-2的基因表达。方法:随机将未感染和感染日本血吸虫尾蚴昆明小鼠分成A^F 6组。即未感染空白对照组(A组)、模型组(B组)、溶剂组(C组)、丹酚酸B治疗低剂量[5mg/(kg·d)]组(D组)、中剂量[10mg/(kg·d)]组(E组)、高剂量[15mg/(kg·d)]组(F组),每组10只。实验结束处死小鼠,留取肝脏组织和血清。用ELISA法检测血清MMP-1及TIMP-1的含量,逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测小鼠肝组织MMP-1mRNA及TIMP-1mRNA的表达。结果:免疫组化检测显示,给予丹酚酸B治疗后,D、E、F组的MMP-1蛋白表达增加,而TIMP-1蛋白表达降低,与模型组比较差异有统计学意义。逆转录PCR检测结果表明,D、E、F组的MMP-l mRNA表达增加,而TIMP-1mRNA表达降低,与模型组比较差异有统计学意义。结论:丹酚酸B具有抗血吸虫性肝纤维化作用,可能通过增加MMP-1表达,抑制TIMP-1表达而促进肝纤维化的逆转。     

谷氨酰胺对肠粘膜上皮细胞合成多聚免疫球蛋白受体的影响

目的:研究谷氨酰胺对体外培养肠上皮细胞合成多聚免疫球蛋白受体的胞外部分分泌片的影响,以探讨谷氨酰胺保护肠粘膜屏障功能的作用机制。方法:Caco-2细胞(20-30代)应用含有不同浓度谷氨酰胺(0、0.1、1、4mM)的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后进行实验。应用蛋白印迹杂交方法检测各组分泌片蛋白的合成;应用实时定量PCR方法检测各组分泌片mRNA的表达。结果:Western blot分析显示随着谷氨酰胺浓度的增加,Caco-2细胞合成分泌片蛋白的含量明显增加。实时定量PCR结果与Western blot结果一致,随着谷氨酰胺浓度的增加,Caco-2细胞分泌片mRNA的表达逐渐升高。结论:谷氨酰胺可以促进Caco-2细胞分泌片蛋白的合成,这一作用通过增加分泌片mRNA表达实现。     

番茄红素对血脂及TNF-α mRNA表达的影响

目的：通过建立家兔动脉粥样硬化模型,观察TNF-α mRNA在实验性动脉粥样硬化家兔心脏和主动脉平滑肌细胞内的表达及番茄红素对其表达的影响.方法：将家兔按性别、体质量划分区组,随机分为5组,即空白组（N）、模型组（M）、番茄红素小剂量组（LS）、番茄红素大剂量组（LL）、血脂康组（X）.每组各6只,雄雌均等.空白组每日给予普通饲料,其余各组每日每只给予高脂饲料连续造模60d,从第61日起,灌胃给药,番茄红素高剂量组灌番茄红素液50mg/（kg.d）; 番茄红素低剂量组灌番茄红素液16.6mg/（kg.d）; 血脂康对照组灌血脂康56mg/（kg.d）; 空白对照组、模型组给予蒸馏水,连续用药40d后,测定血清脂质（TC,TG,HDL,LDL）含量.采用RT-PCR法检测TNF-α在主动脉和心脏mRNA的表达.所有数据经SPSS13.0软件进行统计分析.结果：番茄红素高剂量组家兔血清TG含量明显低于模型组（P〈0.05）,而番茄红素小剂量组与模型组比较无统计学差异.RT-PCR实验表明番茄红素能够抑制家兔主动脉和心脏TNF-αmRNA的表达.结论：番茄红素可以防止或延缓家兔动脉粥样硬化病变的形成,对动脉粥样硬化家兔的血脂和脂蛋白代谢紊乱具有调节作用,其作用机制可能与抑制TNF-αmRNA的表达有关.     

依达拉奉对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织MMP-9的影响

目的观察依达拉奉对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠脑组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响,探讨依达拉奉对新生大鼠HIBD的保护作用。方法随机将7日龄Wistar大鼠108只分为3组（假手术组、HIBD组、依达拉奉治疗组）,每组36只。根据造模后处死时间,各组又分6个亚组：6h、1d、2d、3d、5d、7d组,每亚组各6只。通过结扎左颈总动脉和吸入8%低氧混合气制备缺氧缺血性脑损伤（HIBD）动物模型。假手术组动物只分离左颈总动脉,不结扎,亦不做低氧处理。治疗组于缺氧缺血后即刻给予腹腔注射生理盐水稀释的依达拉奉注射液（2mg/kg,每24h1次,连续5d。HIBD组和假手术对照组腹腔注射等量生理盐水）。分别于相应时点断头处死各组动物,取脑,采用干湿质量法测定大鼠脑组织含水量,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测MMP-9mRNA的表达情况。结果 HIBD组大鼠脑组织含水量在缺氧缺血后逐渐上升,2d时达到高峰,各时间点均高于假手术组（P〈0.05）。同时,MMP-9mRNA表达量与脑含水量呈相应逐渐上升改变,MMP-9mRNA表达量与脑组织含水量呈正相关。依达拉奉治疗组与HIBD组相比,脑组织含水量明显下降（P〈0.05）,MMP-9mRNA表达量显著下调（P〈0.05）。结论 MMP-9参与了HIBD脑水肿的发生发展过程,依达拉奉可降低脑组织MMP-9的表达,从而减轻脑水肿,这可能是其脑保护作用机制之一。     

HIF -1α在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

目的：检测膀胱移行细胞癌（BTCC）中HIF-1α的表达情况,初步探讨HIF-1α在BTCC中表达的临床意义。方法：应用免疫组织化学及RT-PCR技术检测BTCC和正常膀胱组织中HIF-1α蛋白和mRNA表达情况,并分析其表达与肿瘤临床分期、病理分级及复发的关系。结果：免疫组织化学染色显示,12例正常膀胱组织未发现HIF-1α阳性表达,57例BTCC中有30例HIF-1α表达阳性,阳性表达率为52.6%。其表达与肿瘤的病理分级无关,但与肿瘤的临床分期及复发相关。RT-PCR检测显示,BTCC中HIF-1αmRNA的阳性表达率高于正常膀胱组织,差异具有统计学意义,但BTCC中HIF-1αmRNA的表达与其蛋白水平表达无明显相关性。结论：在BTCC中,HIF-1α的表达明显上调,可能在BTCC的侵袭等生物学过程中具有重要的作用。     

小鼠胃和阑尾组织中h-CD降解规律与死亡时间的相关性研究

目的：观察小鼠死亡后不同时间胃和阑尾组织中h-CD含量的变化,探讨不同温度条件下h-CD的降解规律与死亡时间的关系及其组织差异性。方法：选取72只健康成年昆明小鼠,采用机械性窒息致死后,随机分为两组,分别置于4℃冰箱和25℃人工气候箱中,并于死后0、24、48、72、96、120 h提取胃及阑尾组织,采用免疫印记及计算机图像分析技术检测上述组织中h-CD的含量,应用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。结果：①h-CD的含量随死亡时间的延长而降低,与死亡时间具有相关性;②不同温度条件下,胃和阑尾组织中h-CD的降解速度均存在明显差异（P〈0.05）,h-CD在25℃组降解速度快于4℃组（P〈0.05）;③h-CD的降解速度在胃和阑尾组织中存在组织差异性,在阑尾组织中的降解速度较快（P〈0.05）。结论：h-CD的含量随死亡时间延长而降低,其降解速度受环境温度影响,温度升高,降解速度加快,且胃和阑尾组织中h-CD的降解速度具有组织差异性,其在阑尾组织中的降解速度快于胃组织中的降解速度。     

调心方有效部位TX0201对类AD模型大鼠脑内APP mRNA与Caspase-3表达的影响

目的：观察调心方有效部位TX0201对Aβ1-40双侧杏仁核注射所致的类阿尔茨海默病（AD）模型大鼠脑内APP mRNA、Caspase-3表达的影响。方法：应用β淀粉样蛋白1-40片段（Aβ1-40）注射入大鼠双侧杏仁核建立类AD的动物模型。实验设正常对照组、类AD模型组、TX0201组、调心方组、安理申组,均采用灌胃给药20d;分别用RT—PCR法、免疫组化法检测大鼠脑部皮层和海马的APP mRNA、Caspase-3表达。结朵：TX0201和调心方均能明显降低大鼠皮层、海马APP（MPI） mRNA和APP（KPI） mRNA的表达。模型大鼠大脑海马CA2区和皮层Caspase-3蛋白阳性细胞表达明显增多,调心方和TX0201均能明显调低Caspase-3蛋白阳性细胞的表达。结论：TX0201可能通过降低皮层、海马部位APP mRNA的表达,下调Caspase-3,减轻神经细胞凋亡,从而发挥保护神经元作用。     

大鼠全脑照射后海马区VEGF表达变化及超微结构改变

目的探讨单次大剂量全脑照射后大鼠海马区血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化及其超微结构改变。方法以雌性SD大鼠作为研究对象,使用RT—PCR检测全脑照射后大鼠海马区VEGFmRNA的表达变化,电镜观察照射后大鼠海马区神经元线粒体及血管内皮等超微结构改变。结果全脑照射后1d大鼠海马区VEGFmRNA表达出现短暂下降,放疗后1、2、4和8周时VEGFmRNA表达水平与对照组比较均无统计学差异（均P〉0．05）。20Gy放疗后4周,大鼠海马区神经元出现线粒体水肿,空泡形成;毛细血管内皮间隙增加,管腔狭窄。结论VEGF参与大鼠脑部放疗后损伤应答反应,这可能为将来的脑损伤防护提供新的靶点。