不同浓度胰岛素对小鼠神经干细胞分化的影响

目的 体外培养获得神经干细胞并初步探讨不同浓度胰岛素对神经干细胞分化能力的影响。方法 小鼠胎脑细胞体外培养获得神经干细胞,并行免疫荧光检测鉴定。25ng／ml、50ng／ml、100ng／ml、125ng／ml、150ng／ml胰岛素诱导分化后,免疫荧光染色观察不同浓度胰岛素对神经干细胞分化的影响。结果 体外培养的神经球表达巢蛋白（nestin）,神经球分化的细胞表达神经丝和胶质纤维酸性蛋白。不同浓度胰岛素作用下的神经元分化率有差别。其中100ng／ml组的分化率最高。结论 体外培养的细胞为神经干细胞,100ng／ml浓度的胰岛素可以起到较好的促进神经元分化的效果。     

葡萄糖浓度对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对神经干细胞增殖、分化的影响。方法胚胎小鼠脑细胞原代培养并鉴定。生理浓度和高浓度葡萄糖培养及诱导分化后．四唑盐比色（MTT）法及免疫荧光法观察两组不同葡萄糖浓度对神经干细胞增殖、分化的影响。结果原代培养的神经球表达巢蛋白（hestin），神经球分化的细胞表达神经丝200（NF200）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。与生理浓度葡萄糖相比，高浓度葡萄糖降低了神经干细胞的增殖活力：分化3d后，高糖组的NF200阳性细胞和GFAP阳性细胞比例高于生理浓度组（P〈0．01），而nestin阳性细胞比例则反之（P〈0．01）；分化10d后，神经干细胞完全分化，免疫荧光检测发现生理浓度葡萄糖提高了NF200阳性细胞比例。结论高糖损害了神经干细胞的增殖活性。加速了神经干细胞的早期分化．降低了神经元的分化率。     

去分化肌肉干细胞神经增殖与分化能力的研究

目的研究和鉴定去分化肌肉干细胞是否具有神经增殖和分化能力。方法使用不同的条件性培养基,对去分化肌肉干细胞依次进行神经增殖和神经分化诱导,并通过形态学、免疫细胞荧光化学、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等手段加以鉴定。结果①去分化肌肉干细胞在神经增殖培养基诱导下,形成典型神经球(neurospheres)结构,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记阳性,抗巢蛋白(Nestin)阳性;RT-PCR提示肌形成蛋白(myogenin)表达水平下调,而Nestin、干细胞抗原-1(Sca-1)表达上调。②经神经分化培养基诱导,神经球细胞可分化为形态学上典型的、抗中间神经丝蛋白(NFm)阳性神经元。结论去分化肌肉干细胞具有神经增殖和分化潜能。     

嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.     

食蟹猴神经干细胞的培养与分化

背景：关于神经干细胞以往研究多集中在啮齿类和人类,涉及非人灵长类的神经干细胞研究较少。 目的：建立食蟹猴神经干细胞的体外分离培养方法,并观察其分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-07/2009-04在中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。 材料：孕3~5个月的食蟹猴流产胚胎,由蓝岛生物技术有限公司(华南非人灵长类研究开发中心)提供。 方法：取食蟹猴胚胎的室管膜下区及海马区脑组织,放入神经干细胞悬浮培养液中,巴氏吸管吹打分散,得到单细胞悬液,调整细胞浓度为(2.0~5.0)×105接种于25 cm2培养瓶中,在37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下进行原代悬浮培养。待形成神经球2周后,接种于预先包被多聚鸟氨酸/纤维连接蛋白的培养板上进行贴壁培养。每天向孔内添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子各20 μg/L,待细胞增殖到90%左右传代扩增。 主要观察指标：利用免疫细胞荧光化学技术,对体外培养的食蟹猴神经干细胞表面标志性抗原nestin及其分化潜能进行鉴定。 结果：悬浮培养1周后,倒置显微镜下可见神经球形成,神经球在培养过程中逐渐增大。第4周将神经球进行贴壁培养后,24 h可见神经球贴附于板壁,并有突触从球中伸出,随后大量细胞从神经球中迁出,逐渐铺满板壁。添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子培养的神经干细胞呈nestin+,而未添加两种因子的神经干细胞呈GFAP+,Tuj 1+,O4+。 结论：悬浮培养与贴壁培养相结合的方法较适合食蟹猴神经干细胞的培养及传代,分离出的食蟹猴神经干细胞具有分化为 星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞的能力。     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化.方法取孕16 dWistar大鼠的胚鼠全脑,进行体外培养,并对培养的神经干细胞以及诱导分化的GABA能神经元进行鉴定.结果培养24h后,出现2～4个细胞的细胞球.分化2d后,神经球贴壁后伸出细长突起,并可和周边神经球伸出的突起连接.神经球周边可见大量散在贴壁的双极或多极细胞.免疫荧光染色可见神经球均有nestin、NF200、GFAP阳性细胞.取第3代神经球行GABA能神经元定向分化.分化24h后,实验组细胞球贴壁.3d后,实验组细胞球周边有大量散在分布细胞贴壁生长,胞体圆形较大,有1～2个细长突起.免疫荧光显示,实验组周边散在的贴壁细胞多为GAD65阳性细胞.GAD65阳性细胞分化率实验组(85.97±2.78)%、对照组(18.16±2.29)%,P<0.01.结论本实验利用寡核苷酸序列特异性阻断了bHLH基因家族的调控因子之一Hes1,解除了其对bHLH的抑制,促进了神经干细胞向神经元的分化.实验还发现,阻断Hes1后大大提高了神经干细胞向GABA神经元分化的比率.     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

胰岛素样生长因子1在脑梗死大鼠神经干细胞增殖、迁移和分化中的作用*

背景：胰岛素样生长因子1是一种多肽类激素,已证明其对前体细胞增殖有促进作用。 目的：探讨静脉注射胰岛素样生长因子1对大鼠脑缺血后神经干细胞增殖、迁移和分化的影响。 方法：成年雄性SD大鼠80只,随机分为对照组和实验组,40只/组。两组大鼠均采用改良线栓法制备局灶性脑缺血模型,实验组大鼠通过尾静脉注射胰岛素样生长因子1,按100 μg/kg计算,连续注射6 d;对照组给予等剂量的生理盐水。分别于干预后7,14,21,28 d断头去脑,各组分别在处死前1 d腹腔注射BrdU。采用免疫组织化学及其双重染色法检测BrdU阳性细胞、PSA-NCAM阳性细胞、BrdU+PSA-NCAM双阳性细胞、BrdU+MAP2双阳性细胞的表达。 结果与结论：BrdU阳性细胞、PSA-NCAM阳性细胞数均在缺血后7 d最多;BrdU+PSA-NCAM双标阳性细胞在缺血后双侧室管膜下区和海马齿状回区均可以检测到,于7 d计数最多,之后逐渐减少;BrdU+MAP2双阳性细胞却从14 d开始逐渐增多,随BrdU+PSA-NCAM双阳性表达的逐渐降低,BrdU+MAP2双阳性表达逐渐增高,呈现此消彼涨的变化。提示静脉途经给予胰岛素样生长因子1能诱导大鼠缺血性脑损伤后神经干细胞的增殖、分化和迁移。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

Fusion of neural stem cells in culture

An important issue in stem cell biology relates to mechanisms of cellular plasticity. Specifically, could any observed multipotency of, e.g., adult stem cells arise from true transdifferentiation or as a result of cell-cell fusion? We studied this issue using a culture paradigm of astrocyte monolayers and multipotent neurospheres generated from neonatal cerebellar cortex and the subventricular zone (SVZ). Based on fluorescence in situ hybridization (FISH), cells from these cultures were found to contain an abnormal number of sex chromosomes, suggesting that cellular fusion is a common in vitro occurrence. A Cre/lox recombination method was also exploited to further confirm the evidence of fusion. Next, we assessed the potential of fusogenic microglial involvement by combining CD11b immunolabeling with FISH sex chromosome analysis. Differentiating neurospheres were also studied from the PU.1 knockout mouse that lacks cells of myeloid origin, presumed to be a source of central nervous system microglia. Very few cells immunopositive for the microglial marker CD11b were found to be aneuploid, and there was no difference in fusion frequency between PU.1+/+ and PU.1-/- neurospheres. These results, together, suggest that stem and/or progenitor cells that generate neurons and glia in culture possess the ability to generate fused polyploidal cells, but microglial participation is not a requirement for fusion to occur. In addition to caution that should be exerted during the interpretation of in vitro neural cell plasticity, the data also suggest that novel therapeutic treatments could be designed that exploit cellular fusion in rescue paradigms for degenerating neuronal populations.     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

体外神经干细胞培养特性观察

目的 探讨神经干细胞(NSCs)体外分离培养和增殖的特性.方法 从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养.倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达.结果 从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球.神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原.结论 从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力.     

胚胎小鼠脊髓源性与纹状体源性神经干细胞的培养及分化特点

目的 探讨小鼠脊髓源性神经干细胞与纹状体源性神经干细胞的分离培养方法 及增殖特点,比较两种来源的神经干细胞发育时期上的异同,寻找更有利于脊髓损伤修复的种子细胞.方法 利用显微解剖、无血清培养和单细胞克隆技术在孕14 d小鼠的胎鼠的脊髓及纹状体中分离培养具有单细胞克隆能力的细胞,免疫荧光染色检测克隆细胞的神经巢蛋白(nestin)抗原和诱导分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达,并比较两种来源的干细胞在培养及分化方向上的异同点.结果从胎鼠的脊髓和纹状体中成功分离出神经干细胞.两种来源的干细胞均具有连续克隆能力可传代培养,表达nestin.脊髓血清诱导分化后脊髓源性神经干细胞β-tubulinⅢ阳性细胞(13.5±0.8)较纹状体源性神经干细胞(17.4±1.1)减少,而nestin、GFAP阳性细胞明显增多(45.7±0.3vs 39.2±1.2;25.2±1.3 vs 18.8±0.9),差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 依据细胞增殖特点和分化结果的区别,证实纹状体源性神经干细胞更适合用于移植修复脊髓损伤.     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。