益骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞IL-6 mRNA及其蛋白表达的影响

目的：从mRNA及蛋白水平探讨益骨胶囊含药血清对成骨细胞表达IL-6的影响。方法：分离、培养新生SD大鼠成骨细胞，传代后分为3组即含药血清组；空白血清组；DMEM组。采用RT-PCR法检测IL-6 mRNA相对表达量，用放射免疫法检测成骨细胞培养上清中的IL-6含量。结果：益骨胶囊含药血清组IL-6 mRNA相对表达量显著低于对照组（P<0.05）；益骨胶囊含药血清组IL-6蛋白表达量也低于对照组（P<0.05）。结论：益骨胶囊含药血清能下调成骨细胞IL-6 mRNA 表达；亦能在蛋白水平降低成骨细胞分泌骨吸收因子IL-6，这可能是益骨胶囊防治骨质疏松症的机制之一。     

益骨胶囊含药血清对共育体系中成骨细胞表达骨保护素mRNA的影响

目的 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠成骨细胞表达骨保护素(OPG)mRNA的影响.方法 取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞(OB);取5d龄SD大鼠四肢长骨分离培养破骨细胞(OC).建立上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系,实验分为含药血清组和对照组.将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组,制备含药血清和对照血清.检测共育体系中成骨细胞OPG mRNA的表达.结果 含药血清组与对照组比较,OPGmRNA表达明显升高(8.2567±0.1118比3.3350±0.9854),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 益骨胶囊含药血清在共育体系中通过刺激OB表达OPG来实现对OC的活性和凋亡的调节.     

益骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞IGF-ImRNA及其蛋白表达的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对SD大鼠成骨细胞(OB)增殖和胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA及其蛋白表达的影响。方法:(1)将40只12月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组(高、中、低剂量)和蒸馏水对照组,制备含药血清和对照血清,并确定最佳灌胃剂量和最佳血清添加浓度;(2)分离、培养新生大鼠成骨细胞,传代后分为两组(含药血清组和对照组),分别在培养48、72和96 h时做相关指标的测定,采用MTT法测定OB增殖,RT-PCR法检测IGF-ImRNA的相对表达量,ELISA法检测培养上清中IGF-I的浓度。结果:在48、72和96 h时,益骨胶囊含药血清组OB增殖明显高于对照组(P<0.01),OB表达IGF-I mRNA和蛋白的量明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论:益骨胶囊含药血清具有促进成骨细胞增殖、表达IGF-I mRNA和蛋白的作用,可能是该方防治骨质疏松的机理之一。     

TNF-α对共育体系中成骨细胞凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用

目的： 探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成骨-破骨细胞共育体系中成骨细胞（OB）凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用。方法: （1）将20只10月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组，制备含药血清与空白血清；（2）将分离的OB与破骨细胞（OC）分别接种到共育体系中，加培养液培养后， 同时添入20 μg/L、30 μg/L、40 μg/L、50 μg/L、60 μg/L TNF-α分别作用24 h、48 h、72 h诱导OB 凋亡，用DNA电泳法确定最佳诱导方案；(3）将细胞分为TNF-α组、TNF-α+含药血清组、TNF-α+空白血清组和正常对照组，分别加入DMEM培养液、含药血清培养液、空白血清培养液、DMEM培养液，除正常对照组加入PBS外，其它各组均同时加入60 μg/L TNF-α，培养72 h后，用荧光染色法、DNA电泳法、流式细胞仪观察各组OB凋亡情况。结果: (1）60 μg/L TNF-α作用72 h后，共育体系中OB DNA电泳呈较典型的梯形改变；(2）TNF-α+含药血清组中OB DNA电泳仅出现二个条带，荧光染色可见大多数细胞均匀染色，其凋亡率（9.60%±0.26%）明显低于TNF-α组(26.90%±0.06%)与TNF-α+空白血清组(18.10%±0.06%)，P＜0.01。结论: 60 μg/L TNF-α作用72h可诱导共育体系中OB凋亡；益骨胶囊含药血清对TNF-α诱导的OB凋亡具有抑制作用。     

益骨胶囊含药血清对共育体系中破骨细胞活性和凋亡的影响

目的： 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠破骨细胞（OC）活性和凋亡的影响。 方法： (1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞（OB），取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养OC，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系，实验分为含药血清组和对照组；（2）将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组，制备含药血清和对照血清；（3）重氮盐法检测抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和光镜观察骨陷窝数；（4）光镜和荧光显微镜下观察共育体系中OC凋亡情况。 结果： 含药血清组在48 h、72 h、96 h对成骨-破骨细胞共育体系中OC分泌TRACP的活性均明显降低于对照组，OC的存活数明显低于对照组，OC的凋亡率明显高于对照组且呈明显的时效关系；所形成骨吸收陷窝的数目明显低于对照组(P<0.01)。 结论： 益骨胶囊含药血清在共育体系中能够抑制OC活性，诱导破骨细胞的凋亡。     

密骨打老儿丸含药血清对共育体系中成骨细胞和破骨细胞功能的影响

 目的： 观察密骨打老儿丸（Migu-Dalaoer pill,MDP）含药血清在成骨-破骨细胞共同培养体系中对成骨细胞（osteoblasts,OB）增殖和破骨细胞（osteoclasts,OC）骨吸收功能的影响。方法： 利用分段酶消化法从胎鼠颅骨中分离出OB,取1日龄SD大鼠四肢股骨和胫骨分离培养OC,建立培养上清相通但2种细胞间互不接触的成骨-破骨细胞共育模型。实验分为不同浓度（低、中、高）的MDP含药血清组和对照组进行比较,以细胞增殖（MTT 法）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性代表OB的成骨活性,以抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）活性和骨吸收陷窝数目代表OC的破骨能力进行测定。结果： 与对照组相比,中、高浓度MDP含药血清在成骨-破骨细胞共同培养体系中6和7 d 能显著提高OB数目和 ALP 活性（P<0.01）。与对照组相比,中、高浓度MDP含药血清在成骨-破骨细胞共同培养体系中6和7 d 能显著降低OC骨吸收陷窝的数目和分泌 TRAP 的活性（P<0.01）。结论： 密骨打老儿丸含药血清在共育体系中能够促进OB增殖和骨形成,同时抑制OC骨吸收功能。     

益骨胶囊含药血清对大鼠破骨细胞凋亡和分泌抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对体外培养的大鼠破骨细胞(OC)分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和凋亡的影响。方法:(1)将20只12月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组, 制备含药血清和对照血清;(2)分离培养新生SD大鼠OC, 加血清培养后, 重氮盐法检测TRAP, 倒置显微镜下观察OC存活数及荧光染色法观察OC凋亡情况。结果:与空白血清组比较, 含药血清组在24h、48h和72h时TRAP的活性均明显降低, OC存活数明显降低, 凋亡比率明显高(P<0.01或P<0.05)。结论:益骨胶囊含药血清可以抑制体外培养OC分泌TRAP, 诱导OC凋亡, 提示这可能是该方防治骨质疏松的机理之一。     

益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织cbf α-1mNRA表达的影响

目的： 分析成骨细胞分化因子cbf α-1基因在去卵巢骨质疏松（OP）大鼠的表达水平，观察益骨胶囊的调节作用。方法: 将36只10月龄SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、药物组,相应干预后,留取股骨,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术测定cbf α-1 mRNA表达,以GAPDH基因为内参照,根据相对定量公式(2-ΔΔCt)分别计算模型组、药物组与假手术组表达差异倍数。结果: 根据相对定量公式分析显示:与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中cbf α-1 mRNA表达下降（P<0.01）。而药物组cbf α-1 mRNA表达相当于假手术组的0.19－0.92倍(P>0.05)，明显高于模型组（P<0.05）。结论: 结果表明去卵巢OP模型大鼠骨组织cbf α-1基因表达降低，而益骨胶囊可上调cbf α-1的基因表达水平，这可能与其诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞发挥其防治OP的作用有关。     

高分子量聚乙烯对成骨细胞活性及新骨形成的影响

研究高分子量聚乙烯（Highmolecular weight polyethylene，HMwP）材料对成骨细胞活性及其在骨折愈合过程中对新骨形成的影响。（1）体外实验：在HMWP浸提液和标准培养基中培养成人骨髓源成骨细胞，采用MTT法检测成骨细胞的活性、碱性磷酸酶试剂盒检测成骨细胞的生理功能。（2）体内实验：制作犬股骨远端粉碎性骨折模型，用HMWP板与钢板互锁组合固定，术后3、6、9、12周取材，分别进行HE染色组织学观察及扫描电镜观察HMWP板下骨折端的新骨生成情况。结果发现：（1）采用HMWP浸提液和标准培养基培养的2组成骨细胞，在第2、4、8、14d的增殖能力和碱性磷酸酶活性无统计学差异，P〉0．05；（2）术后不同时间点进行肉眼观察、HE染色组织学观察及扫描电镜观察均可见HMWP板与骨组织之间界面无吸收，HMWP下骨折端的新生骨组织随着时间延长不断成熟。提示：HMWP对成骨细胞的活性及新骨形成均无不良影响，可作为内固定材料应用于骨折的治疗。     

应力缺失致骨质疏松大鼠成骨细胞细胞信号外调节激酶表达及通络生骨胶囊的影响

背景：长期卧床患者和航天员应力缺失导致骨质疏松现象的发生,通络生骨胶囊具有促进骨生成的作用,可能干预应力缺失状态下骨质疏松的发生。 目的：观察应力缺失型骨质疏松动物细胞信号外调节激酶的变化以及通络生骨胶囊对其改善作用。 方法：SD大鼠40只随机分为对照组、模型组、药物高、药物低剂量组,除正常组外以鼠尾悬吊法制备动物应力缺失模型,药物高、低剂量组将通络生骨胶囊按0.6,1.2 g/kg剂量灌胃,1次/d,21 d后,取腿骨,观察骨形态变化及成骨细胞细胞信号外调节激酶的表达水平。 结果与结论：应力缺失导致骨质疏松,对细胞信号外调节激酶总量无显著影响,但显著降低其磷酸化蛋白表达;通络生骨胶囊可显著改善应力造成的骨质疏松状态,但药物高剂量组对磷酸化的细胞信号外调节激酶的表达影响不显著,药物低剂量组则还降低其表达。说明应力缺失通过降低细胞信号外调节激酶磷酸化水平导致骨质疏松,通络生骨胶囊不是通过影响细胞信号外调节激酶通路改善应力缺失导致的骨质疏松的。     

Differential expression of mRNA encoding interleukin-12 p35 and p40 subunits in situ

Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine that plays an important role in the regulation of the immune response. For biological activity the expression of both subunits of IL-12, p35 and p40, is required. Moreover, in the mouse the p40 chain of IL-12 specifically inhibits the effects of the IL-12 heterodimer. In the present study we have analyzed by in situ hybridization the expression of the p35 and p40 mRNA in the spleens of BALB/c and mutant (SCID, nude, beige) mice, unstimulated and after in vivo stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and with staphylococcal enterotoxin B (SEB). In unstimulated spleens of BALB/c mice, p35 and p40 mRNA were only detectable in a few strongly stained single cells, p35 mRNA was expressed in addition weakly in the B cell areas. After injection of LPS or SEB, p40 mRNA was strongly induced in the T cell areas all over the spleen, whereas expression of p35 mRNA and its distribution pattern did not change. Surprisingly, most of the mRNA for p35 and p40 was localized in different areas of the spleen and was apparently produced by different cells. In macrophage-depleted spleens the increased expression of p40 mRNA in response to LPS was reduced but still detectable, demonstrating that other cells besides macrophages can up-regulate IL-12 p40 mRNA. Nude mice showed a stronger expression of p35 mRNA, SCID mice lacked the weak p35 staining of the B cell areas but showed a strong basal expression of both p35 and p40 mRNA and a focal response to LPS. The pattern of IL-12 mRNA expression in beige mice was the same as in normal mice. These data demonstrate a spatial dissociation of expression of the two chains of IL-12 and are compatible with a regulatory role of the isolated IL-12 p40 chain in vivo. In addition, they indicate that the demonstration of mRNA for both chains of IL-12 in whole tissues or cell mixtures is not necessarily indicative of functional IL-12.     

梓醇对OB-OC共育体系中OB、OC活性及OBERα、βmRNA表达的影响

目的:观察中药单体梓醇在成骨-破骨共育体系中对成骨细胞(OB)增殖、OB碱性磷酸酶(ALP)活性、破骨细胞(OC)活性及OB雌激素受体(ER)α及βmRNA表达的影响,从细胞水平阐释其防治骨质疏松症的作用机制。方法:分别选取1 d和5 d SD大鼠分离培养OB和OC,并建立OB-OC共育体系;在共育体系中,用MTT法检测低浓度(0.05、0.1、0.5、1 mg/L)、中浓度(2、5、10 mg/L)和高浓度(20、50和100 mg/L)梓醇干预下的OB增殖率,并以梓醇最佳促OB增殖浓度进行后续实验,实验分为对照组和梓醇组。p NPP法检测各组OB的ALP活性;光镜观察OC骨吸收陷窝数目;重氮盐法检测OC抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性;RT-PCR方法检测OB ERα及ERβmRNA的表达。结果:在OB-OC共育体系中,0.05~2 mg/L梓醇各组中OB的增殖率显著高于对照组(P0.01),且0.05 mg/L梓醇组促进OB增殖的能力明显高于其它浓度组(P0.01),5~100 mg/L梓醇各组OB的增殖率与对照组比较无显著差异(P0.05)。0.05 mg/L梓醇组的ALP水平高于对照组(P0.05),并在作用48、72和96 h后均对OC骨吸收陷窝数及TRAP有明显抑制作用(P0.01);0.05 mg/L梓醇组OB中ERαmRNA的表达与对照组相比差异无统计学意义(P0.05),而ERβmRNA的表达显著高于对照组(P0.05)。结论:梓醇在共育体系中可提高OB增殖和成骨活性,抑制OC活性并上调OB中ERβmRNA的表达。     

杂色曲霉素对小鼠脾细胞IL-4 mRNA表达和蛋白分泌的影响

目的：探讨杂色曲霉素（ST）对体外培养的小鼠脾细胞IL-4 mRNA表达及其蛋白分泌的影响。 方法： 分别采用半定量RT-PCR及ELISA方法，研究5种不同剂量ST（0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L）预处理2 h、12 h对小鼠脾细胞IL-4 mRNA表达及其蛋白分泌的影响，观察ST对IL-4影响的时效及量效关系。 结果： ST预处理2 h，较小剂量ST（0.125、0.25、0.5 mg/L）处理组小鼠脾细胞IL-4 mRNA的表达高于对照组，以0.5 mg/L组表达最高；当ST预处理达到12 h时，较小剂量ST处理组IL-4 mRNA表达均低于对照组，其中以ST 0.125、0.25 mg/L组降低最明显。而大剂量ST（1 mg/L、2 mg/L）处理2 h及12 h对小鼠脾细胞IL-4 mRNA表达均低于对照组。在蛋白水平上的改变与mRNA水平变化相似。 结论： ST对小鼠脾细胞IL-4 mRNA表达的影响与其剂量和作用时间有关，既可表现为抑制作用，也可表现诱导作用。     

肝硬化对肝脏UGT mRNA表达的影响

目的：探讨肝硬化及肝纤维化对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）表达水平的影响。 方法： 应用RT-PCR和Southern杂交技术，观察肝硬化患者肝脏组织中UGT同工酶mRNA表达水平的差异,及肝纤维化对UGT表达水平的影响。 结果： 肝硬化组UGT2B15、UGT1A6的mRNA水平高于对照组分别为227%和166%;肝纤维化对UGT2B15RNA的表达有显著的影响，4级肝纤维化患者UGT2B15 mRNA水平为0级肝纤维化的172％、1级的208％、2级的243％。3级肝纤维化患者UGT2B7 mRNA水平为0级肝纤维化的192％、1级的208％、2级的156％。 结论： 肝硬化可影响肝脏葡萄糖醛酸转移酶同工酶的表达水平；肝纤维化对UGT mRNA的表达有显著的影响。