ID4基因启动子克隆及表达调控载体的构建

目的深入研究ID4基因的表达调控机制。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列,设计PCR扩增引物,采用分段扩增法,从健康人外周血中扩增获得2条长度分别为1829bp和784bp的产物片段,插入用于表达调控研究的pGL3Basic荧光素酶报告载体,实现连接,经测序鉴定。以此为基础进行亚克隆,分别获得5条5′端不等、3′端平齐的片段,插入pGL3Basic载体。结果获得了6条长度依次差别约为400bp的ID4启动子克隆,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体。结论成功克隆了人ID4基因启动子并构建了表达调控载体,为研究ID4启动子活性及表达调控奠定了基础。     

前列腺特异性抗原启动子调控促凋亡基因caspase-7载体的构建及其对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用

目的：构建前列腺特异性抗原启动子(PSAP)调控的促凋亡基因caspase—7表达载体并观察其对前列腺癌细胞的促凋亡作用．方法：提取基因组DNA，通过PCR法获得前列腺特异性抗原启动子(PSAP)基因，利用基因重组方法以PDAP替换掉pCDNA3真核表达载体中的pCMV启动子，构建PSAP-pCDNA3载体．测序正确后，将PSAP分别替换绿色荧光蛋白载体pIRES2—EGFP和克隆入带有效应型caspase-7基因的绿色荧光蛋白载体pIRES2—EGFP—Csp7中的pCMV启动子片段，分别获得由PSAP启动子调控的绿色荧光蛋白载体和带有效应型Caspase—7基因的真核表达载体PSAP—pIRES2—EGFP—Csp7．利用脂质体转染法将该载体分别转染至PC—3m(前列腺癌)、Hep2(喉癌)及MC3T3(正常成纤维)细胞中，通过荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白表达及细胞形态变化，免疫组化检测细胞中效应型Caspase—7蛋白的表达状况，细胞计数观察转染不同表达载体后各类细胞生长变化．结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确．转染PSAP—pIRES2—EGFP—Csp7载体后，①在PC—3m细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达，并可检测到效应型Caspase—7蛋白表达，而在Hep2及MC3T3细胞中未观测到绿色荧光，②荧光显微镜下可见前列腺癌PC—3m细胞生长受到抑制并出现凋亡细胞形态，细胞计数证实转染的PC—3m细胞生长受到抑制，而其余细胞生长未受影响．②电镜观察结果显示转染PSAP—pIRES2—EGFP-Csp7后的PC-3m细胞出现典型的凋亡细胞形态．结论：前列腺特异性抗原启动子(PSAP)可在前列腺癌细胞中特异性调控其下游Caspase—7基因的表达，并发挥其促凋亡作用，从而特异性地诱导前列腺癌细胞发生凋亡，而对正常细胞及非前列腺起源细胞不产生影响．     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.     

修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定

目的 :构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶 (hTERT)核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶 (FCY1)的复制缺陷型重组腺病毒 .方法 :构建由雌激素反应元件 (ERE)和缺氧反应元件 (HRE)串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子 ,将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶 (FCY1)基因插入穿梭质粒 ,用穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK 2 93细胞 ,获得重组腺病毒载体Ad EHhT FCY1,经PCR鉴定证实后 ,采用终点稀释试验测定病毒滴度 .结果 :经 2 4HRE与 8ERE共修饰的hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确 ;穿梭质粒和辅助质粒共转染的HEK 2 93细胞 ,在转染后 7～ 10d出现了典型的细胞病变反应 (CPE) ,PCR反应能扩增出 12 2bp的目的片段 ,终点稀释试验测定得到的病毒滴度为 6 2× 10 7pfu·mL-1.结论 :成功构建并获得高滴度的ERE与HRE串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子引导FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒 .     

小鼠Lrp5基因基本启动子分析

目的：研究小鼠Lrp5基因基本启动子。方法：PCR扩增小鼠Lrp5基因基本启动子序列，构建荧光素酶报告基因表达体系，以PRL—TK为内参照质粒，瞬时转染COS-7细胞，48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果：在小鼠Lrp5基因基本启动子区域，构建了三种荧光素酶报告基因表达体系pGL3—16(-16bp- 132bp)、pGL3—54(-54bp- 132bp)和pGL3—103(-103bp- 132bp)。pGL3—103表达载体的相对荧光素酶活性最高；pGL3—54的相对荧光素酶活性是pGL3—103表达载体的80％；而pGL3—16相对荧光素酶表达活性急剧下降，与阴性对照pGL3-basic的活性相近，无启动子活性。结论：-54bp--16bp区域内含有小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列，其中三个SP1保守序列是小鼠Lrp5基因基本启动子所必需的。     

siRNAi沉默DNMT1基因对肺癌细胞WIF-1启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶(DNMT1)siRNAi对人肺癌A549细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子高甲基化的影响.方法 利用pSilencer 4.1-CMV neo载体,通过siRNAi表达载体法制备DNMT1 siRNAi.将DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot检测观察转染前后肺癌A549细胞DNMT1内DNMT1基因的表达改变,并利用甲基化PCR,直接测序法检测WIF-1基因启动子甲基化水平.结果 构建的DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞后,明显抑制DNMT1基因的表达,mRNA表达下降75%,蛋白表达下调82%;同时,WIF-1基因启动子序列较转染前甲基化水平明显降低.结论 靶向DNMT1的siRNAi可明显下调靶基因DNMT1的表达,并逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平.     

原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态检测

目的研究原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态及其与原发性肝细胞癌发生发展的关系。方法用特异性甲基化PCR（MSP）法检测30例原发性肝细胞癌肿瘤组织和5例正常肝脏组织中p16、p15基因启动子区甲基化状态，并进行统计分析。结果30例原发性肝细胞癌肿瘤组织中p16和p15基因启动子区分别有53．3％（16／30，P〈0．05）和46．7％（14／30，P〉0．05）甲基化，5例正常组织中未发现甲基化。两基因甲基化与原发性肝细胞癌临床病理及HBsAg之间无明显相关性（P〉0．05），两者在原发性肝细胞癌发生中有协同性（相关性和一致性）。结论p16、p15基因启动子区异常甲基化在原发性肝细胞癌中发生频率很高，可能对肝细胞癌发生发展起重要作用。     

Survivin基因启动子的克隆及在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性研究

目的 研究Survivin基因启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性.方法 采用非限制酶方法获得具有酶切黏性末端的Survivin最小启动子,将其克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的载体pEGFP-1和含有荧光素酶Luciferase的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7,荧光显微镜下观察EGFP 的表达情况,同时测定2种细胞中荧光素酶表达的差异.结果 Survivin启动子在MCF7细胞中呈现高转录活性; 而在HBL100细胞中转录活性极低.结论 Survivin启动子在肿瘤细胞MCF7中具有很强的特异性,为进一步开发肿瘤特异性基因治疗奠定了实验基础.     

TRAIL及其受体与抗肿瘤研究

细胞凋亡 (ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)或程序化细胞死亡(ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ ,ＰＣＤ) ,是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。程序化细胞死亡的失调会导致包括癌症、神经退化型紊乱、获得性免疫缺陷综合征等在内的很多     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上,命名为pLNCX-EGFP。设计含有特定酶切位点的引物,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的pLNCX-EGFP载体上,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体pLNT-EGFP。将该表达载体pLNT-EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT-EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pLNT-EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。     

端粒酶启动子肿瘤靶向肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因抗大肠癌细胞的活性研究

目的：探讨端粒酶（hTERT）启动子驱动下肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related Apoptosis-inducing Ligand,TRAIL）基因在大肠癌细胞DLDl和HT-29的表达及其杀细胞作用.方法：通过腺病毒载体系统将hTERT启动子驱动的TRAIL基因转入大肠癌细胞DLDl和HT-29,流式细胞仪检测GFP/TRAIL（绿色荧光蛋白和TRAIL融合基因）的表达和细胞凋亡率,MTT法检测细胞生长抑制率.结果：端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL基因和CMV启动子驱动的GFP（绿色荧光蛋白）基因在DLDl和HT-29内的表达率分别达41.63%和31.4%;GFP/TRAIL基因对DLDl和HT-29细胞的生长抑制率分别达93.5%和74.2%,凋亡率分别是41.1%和25.8%,与PBS和Ad/CMV-GFP的差异都有显著意义（P＜0.05）.结论：端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL融合基因在大肠癌细胞DLDl和HT-29中能够有效的表达;TRAIL基因对大肠癌细胞DLDl和HT-29有明显的抑制生长和促凋亡作用.     

PSA增强子启动子调控Smac基因表达载体的构建

目的 构建携带Smac基因、人前列腺特异性抗原(PSA)增强子(PSAE)/PSA启动子(PSAP)调控的前列腺特异性真核表达载体.方法 切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA 3.1-Smac内部的人巨细胞病毒/T7启动子序列,替换为在前列腺组织特异性表达的PSAE、PSAP调控序列.构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定.结果 成功构建携带Smac基因人PSAE-PSAP调控的前列腺特异性真核表达载体pcDNA3-PSAE-PSAP-Smac质粒.结论 新构建的载体为前列腺癌的靶向基因治疗奠定了基础.     

凋亡诱导基因TRAIL的受体在卵巢肿瘤中的表达

应用RT PCR方法检测 3例正常卵巢、6例良性卵巢肿瘤和 16例恶性卵巢肿瘤组织中TNF家族新成员TRAIL的受体DR5 ,DcR1和DcR2表达。结果显示 :正常人外周血淋巴细胞及 3例正常卵巢组织中TRAIL受体均为阳性表达。良性卵巢肿瘤中DR5阳性表达率为 83.3% (5 /6 ) ,DcR1为 83.3% (5 /6 ) ,DcR2为 10 0 % (6 /6 )。恶性卵巢肿瘤中DR5阳性表达率为 6 8.8% (11/16 ) ,DcR1为 6 8.8% (11/16 ) ,DcR2为 0 % (0 /16 )。提示不同TRAIL受体特别是DcR2表达可能参与了卵巢肿瘤发生过程中细胞凋亡的调控     

TRAIL蛋白联合吉西他宾对肝癌细胞的体外杀伤作用

目的研究肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体（TRAIL）和吉西他宾对肝癌细胞的杀伤作用及联合作用。方法将生长良好的肝癌细胞接种于96孔板,培养24h后,加入不同浓度TRAIL和吉西他宾,倒置显微镜下观察细胞形态变化;利用非同位素细胞增殖试剂盒和流式细胞仪分别检测细胞的生长抑制率和细胞凋亡。结果（1）TRAIL组、吉西他宾组、TRAIL和吉西他宾联合用药组24h后肝癌细胞几乎全部从培养瓶壁脱落;（2）TRAIL与吉西他宾对10株肝癌细胞均有不同程度的生长抑制作用。其中ch—hep-2对TRAIL及吉西他宾最敏感,其IC50分别为24．33ng／ml和328mg／ml;当TRAIL蛋白浓度为500ng／ml时,吉西他宾对ch—hep-2的生长抑制作用明显增强,IC50为065mg／ml,其细胞毒作用增强5倍,流式细胞仪检测两者作用后的细胞,均可检测到细胞调亡峰。结论TRAIL和吉西他宾协同诱导肝癌细胞发生调亡,TRAIL蛋白可明显增加吉西他宾的杀伤效应,它可作为临床肝癌化疗的辅助药物。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达及重新折叠

目的 :人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand ,TRAIL)基因经扩增后 ,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的TRAIL蛋白。方法 :用PCR的方法从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,经序列分析鉴定 ,再克隆到原核表达载体 pET11a ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,电泳鉴定后 ,柱层析纯化 ,重新折叠 ,流式细胞术等方法检测其促凋亡活性。结果 :得到了TRAIL基因 ,并构建了可在大肠杆菌中表达的载体 pET11 TRAIL1(含TRAILcDNA序列 418 933)及可在真核细胞中表达的载体pLNCX TRAIL2 (含TRAILcDNA序列 88 933)。取前者在E .coliBL2 1(DE3)中表达 ,经纯化 ,重新折叠得到了复性的TRAIL蛋白。检测其对人白血病细胞株Jurkat有诱导凋亡的作用。结论 :从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,在大肠杆菌中表达、重新折叠、纯化后 ,经检测得到了有活性的TRAIL蛋白     

人端粒酶逆转录酶单位启动子和存活因子启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用

目的 通过体内外研究人端粒酶逆转录酶单位(hTERT)启动子和存活因子启动子在实现肿瘤基因治疗靶向性中的作用并探讨其应用前景.方法 PCR方法扩增hTERT启动子片段和存活因子启动子片段,并构建包含重组可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的重组腺相关病毒载体.体外转染四株肝细胞癌细胞株及人原代正常肝细胞(PHH),通过EGFP表达及MTT检测启动子活性.体内建立SMMC-7721皮下移植瘤模型,观察瘤内注射rAAV病毒对肿瘤生长的影响.结果 两启动子驱动的外源基因表达具有肿瘤细胞特异性,且它们驱动的TRAIL表达能降低HCC的存活率,而不能降低PHH存活率.以rAAV为载体,hTERT启动子驱动的TRAIL能显著抑制皮下肿瘤生长.结论 肿瘤特异启动子是实现以rAAV为载体的肿瘤靶向基因治疗的潜在手段.     

有效EDRF启动子驱动GFP基因表达的研究

目的 通过克隆不同长度红系分化相关因子(EDRF)基因启动子,驱动GFP基因的表达,探讨EDRF启动子的特点.方法 利用PCR扩增5种不同长度的EDRF启动子(长度分别为697、496、484、372、283 bp),并将启动子分别克隆至pcDNA-GFP栽体上,构建驱动GFP表达载体后,转染NIH3T3和MEL细胞,采用荧光显微镜、流式细胞术比较不同长度启动子的活性.结果 经荧光检测,在NIH3T3和MEL细胞中,372 bp长的启动子(EDRF基因的-116～+256 bp区)驱动GFP荧光强度最亮、阳性细胞最多.FACS分析发现,在MEL细胞中,372 bp启动子组GFP细胞的阳性率明显高于其他长度启动子组(P<0.01);在NIH3T3细胞中,372 bp启动子组GFP细胞的阳性率为(31.0±0.7)%,高于其他长度启动子组(P<0.01),但其他长度启动子组GFP阳性率均高于20%,说明在NIH3T3细胞中EDRF启动子驱动GFP表达的特异性差,而在MEL细胞(红细胞系)中该启动子驱动GFP表达的特异性较强.结论 EDRF启动子(-116～+256)bp区为最有效的驱动基因表达区域,可以用于驱动基因表达的后续研究.