DF3启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及靶向干扰效果的鉴定

目的：构建带有肿瘤特异性DF3启动子、针对hTERT基因的RNA干扰表达载体pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT,探讨该表达载体的肿瘤靶向性基因抑制作用。方法：分别用针对hTERT基因的RNA干扰寡核苷酸序列及DF3启动子取代质粒pGenesil-10-Micro30中原有的miR30序列及CMV启动子,构建pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT载体并进行酶切及测序鉴定。将该载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞及造血干细胞,ELISA法检测hTERT蛋白的表达情况。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实符合设计要求,构建成功。ELISA法检测结果显示,实验组MCF-7细胞及HepG2细胞的hTERT蛋白下降显著（P〈0.05）,其中以MCF-7细胞下降更为明显;造血干细胞实验组则无明显变化（P〉0.05）。结论：DF3启动子调控的hTERT基因的RNA干扰表达载体能有效抑制DF3阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,以乳腺癌细胞效果最为显著,而对端粒酶阳性的正常细胞不产生影响。     

Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

目的：构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法：化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot 技术检测MCF-7细胞和Hela 细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制（P<0.05）,两组之间无明显差异（P>0.05）。结论：Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子，并观察hTERT启动子调控下tk／GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物，以HepG2基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hTERT启动子；分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体：将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后。通过RT—PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况；用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp～ 40bp的核心启动子。RT-PCR和B-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达．hTERT启动子调控的tk／GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞，表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

hTERT及CMV双调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控表达载体调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的效应.方法 将双调控增强型载体及hTERT单启动子载体(作为对照组)分别转染两种端粒酶(+)的人鼻咽癌5-8F细胞及对照组人乳腺癌MCF-7细胞及端粒酶(-)的正常人血管内皮ECV细胞,Stretch PCR法验证5-8F细胞、MCF-7细胞及ECV细胞中端粒酶活性,荧光显微镜下观察TK基因绿色荧光蛋白表达差异,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果.结果 ①Stretch PCR法验证人鼻咽癌细胞5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性星阳性,人血管内皮ECV细胞端粒酶活性呈阴性.②增强型表达栽体转染上述两种端粒酶(+)肿瘤细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,单启动子亦有较强的荧光表达,但比增强型表达载体要弱,而ECV细胞几乎无绿色荧光.③加入GCV后,增强型表达载体对两种端粒酶(+)肿瘤细胞体外增殖均有明显抑制作用,且均高于单启动子组、空载体组及空白对照组,而增强型表达载体转染ECV细胞体外增殖无明显抑制作用.结论 以hTERT启动子及CMV增强子双调控TK基因的表达载体能够靶向杀灭鼻咽癌细胞,且作用明显强于单启动子载体组.这种新型高效、靶向增强型载体有可能成为一种鼻咽癌临床靶向基因治疗的新策略.     

转染肿瘤坏死因子及反向多药耐药基因对乳腺癌细胞耐药基因表达的影响

目的构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们对多药耐药(MDR)基因的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,RT-PCR和免疫细胞化学染色法分别检测转染前后MDR1-mRNA和P糖蛋白表达情况。结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的细胞可见到绿色荧光,转染了pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色荧光,而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色及绿色荧光。转染后的细胞在mRNA水平及蛋白水平明显降低了耐药细胞MCF-7/ADR的MDR1基因的表达。结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,并能抑制MDR1基因在MCF-7/ADR细胞中的表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。     

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的 克隆MDR1及TNF-α基因cDNA，构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体，并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达。方法 应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达，应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性克隆。结果 转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光。而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光。而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光。结论 反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7／ADR中分别及同时获得表达，为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

人端粒酶逆转录酶单位启动子和存活因子启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用

目的 通过体内外研究人端粒酶逆转录酶单位(hTERT)启动子和存活因子启动子在实现肿瘤基因治疗靶向性中的作用并探讨其应用前景.方法 PCR方法扩增hTERT启动子片段和存活因子启动子片段,并构建包含重组可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的重组腺相关病毒载体.体外转染四株肝细胞癌细胞株及人原代正常肝细胞(PHH),通过EGFP表达及MTT检测启动子活性.体内建立SMMC-7721皮下移植瘤模型,观察瘤内注射rAAV病毒对肿瘤生长的影响.结果 两启动子驱动的外源基因表达具有肿瘤细胞特异性,且它们驱动的TRAIL表达能降低HCC的存活率,而不能降低PHH存活率.以rAAV为载体,hTERT启动子驱动的TRAIL能显著抑制皮下肿瘤生长.结论 肿瘤特异启动子是实现以rAAV为载体的肿瘤靶向基因治疗的潜在手段.     

BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究

目的将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF-7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响.方法应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,Western blot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化.MTF比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果外源性BRCA1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显减弱.BRCA1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性明显降低.结论外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力.BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用.     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.     

端粒酶启动子肿瘤靶向TNF相关凋亡诱导配体基因抗大肠癌细胞HT-29的活性研究

目的：探讨在端粒酶（hTERT）启动子驱动下TRAIL基因在大肠癌细胞HT-29的表达及其杀细胞作用。方法：通过腺病毒载体系统将hTERT启动子驱动的TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因转入大肠癌细胞HT-29，流式细胞仪检测GFP／TRAIL的表达和HT-29细胞凋亡率。结果：端粒酶启动子驱动的GFP／TRAIL基因和CMV启动子驱动的GFP（绿色荧光蛋白）基因在HT-29内的表达率分别达31．4％和67．0％；GFP／TRAIL基因对HT-29细胞的生长抑制率和凋亡率分别达74．2％和25．8％，与PBS和Ad／CMV—GFP比差异都有显著性意义（P〈0．05）。结论：端粒酶启动子驱动的GFP／TRAIL融合基因能在大肠癌细胞中有效表达；TRAIL基因对大肠癌细胞HT-29有明显的抑制生长和促凋亡作用。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.