肝癌细胞系Fas/FasL功能与免疫逃逸机制探讨

目的:探讨肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制。方法:用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas及FasL的表达;用激活性Fas单克隆抗体CH11诱导细胞凋亡法检测肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗;用HepG2.2.15与Jurkat细胞共培养法检测细胞表面FasL诱导T细胞凋亡的功能。结果:①HepG2.2.15细胞Fas表达低下,CH11不能诱导其凋亡;②FasL的表达率为18.03%,与Jurkat细胞共培养可诱导Jurkat细胞凋亡;③用中和抗体NOK-2封闭HepG2.2.15细胞表面FasL后,Jurkat细胞的凋亡率由21.41%降为8.91%。结论:肝癌细胞能抵抗Fas介导的凋亡,其表面的FasL可抑制T细胞的免疫功能,Fas/FasL途径是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一,可成为免疫治疗的新靶点。     

ErbB-3结合蛋白Ebp1基因过表达对人肝癌HepG2细胞生长增殖的影响

[目的]探讨ErbB-3结合蛋白Ebp1基因对肝癌细胞生长增殖的影响.[方法]利用脂质体法将pEGFPC1-Ebp1融合质粒转染到人肝癌细胞HepG2中,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白融合基因的表达并建立稳定表达Ebp1基因细胞系,应用Western blot检测转染后目的蛋白的表达,利用平板克隆集落形成观察细胞生长增殖能力的改变.[结果]在荧光显微镜下可见绿色荧光,Ebp1融合蛋白主要表达于胞质,转染pEGFPC1-Ebp1质粒后HepG2细胞中蛋白明显呈高表达;克隆集落形成实验结果表明,pEGFPC1空载体转染组和未转染细胞组相比较,Ebp1过表达细胞克隆集落形成显著增多.[结论]Ebp1过表达可增强人肝癌HepG2细胞增殖.     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

TGFβ1基因codon10(Leu＞Pro)变异对肝脏细胞功能的影响

目的观察TGFβ1基因codon10(Leu>Pro)的单核苷酸多态性(SNP)对肝脏细胞功能的影响。方法构建含codon10(Leu>Pro)的TGFβ1(LAP+成熟态单体)真核表达重组体CMV-Leu、CMV-Pro。在HepG2、LX-2细胞中转染pcD-NA3.1空载体、CMV-Leu、CMV-Pro,培养24h后,ELISA检测细胞培养上清液中TGFβ1的分泌量。MTT实验观察HepG2细胞转染后的增殖情况,流式细胞术检测LX-2细胞转染后CD83的表达。结果转染CMV-Leu和CMV-Pro能增加HepG2、LX-2细胞的TGFβ1分泌量,且转染CMV-Pro的细胞TGFβ1分泌量比转染CMV-Leu的细胞高(P<0.05)。转染CMV-Pro能明显增高HepG2细胞的增殖活性(P<0.01),而转染CMV-Leu能明显增加LX-2细胞CD83的表达率(P<0.01)。结论TGFβ1基因codon10(Leu>Pro)的SNP对肝脏细胞TGFβ1的分泌、细胞增殖活性及CD83的表达具有明显影响。     

CD59与CD3在T细胞活化信号转导中的协同作用

目的前期构建的真核表达载体pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD3分子在T细胞活化信号转导中的相互作用,进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi;脂质体法将两种载体分别转染Jur-kat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系;RT-PCR技术检测转染后CD59和CD3ζ在mRNA水平的表达抑制效果;采用噻唑蓝比色法检测转染前后各组Jurkat细胞的增殖效应,Western Blot技术检测各组细胞ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平,激光共聚焦扫描显微镜检测各组细胞内Ca2+变化,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)的变化。结果重组载体转染后RT-PCR结果表明,转染pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi质粒的细胞组CD3ζ分子和CD59分子的表达分别受到抑制。转染干扰质粒的细胞组细胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平、Ca2+浓度及IL-2水平均明显低于未转染组和空质粒组,差异有显著性(F=96.13～328.60,q=6.27～32.664,P<0.01)。结论 CD59和CD3在T细胞活化信号转导中具有协同作用。     

人maff基因表达载体构建的实验研究及意义

[目的]构建人maff基因表达载体并在人肝癌细胞系HepG2细胞中表达。[方法]PCR（聚合酶链式反应）扩增人maff基因,并将其和克隆质粒连接,转染到大肠杆菌中扩增,酶切鉴定,然后将目的基因和表达载体连接,转染到人肝癌细胞系HepG2细胞中表达并用westernblo（t蛋白质印记）进行鉴定。[结果]经酶切和westernblot鉴定,人maff基因表达载体可在真核细胞内表达Maf F蛋白。[结论]该实验构建了人maff基因真核表达载体,为进一步研究中药预防肿瘤发生提供实验基础。     

IDO基因稳定转染HepG2细胞系的建立

目的建立稳定转染IDO基因的HepG2细胞系,为进一步研究IDO基因在肝癌免疫逃逸中的作用奠定基础。方法应用脂质体将真核细胞表达质粒pcDNA3.1-IDO和空载质粒pcDNA3.1转染入HepG2细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证获得的表达细胞株。结果经RT-PCR和Western blotting检测证实空质粒转染组和空白对照组HepG2细胞无IDO基因及蛋白的表达,而重组质粒组的HepG2细胞表达IDO基因和蛋白。结论 pcDNA3.1-IDO质粒体外稳定转染人肝癌细胞HepG2,可以有效地使IDO基因在RNA水平和蛋白水平均表达,成功建立了稳定转染基因IDO的HepG2细胞系,为进一步探讨该基因的功能奠定了一定基础。     

慢病毒载体介导siRNA沉默Id-1通过ERK1/2信号通路抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长

目的 构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1,观察其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其对ERK1/2信号通路的影响。 方法 构建合成特异性针对Id-1基因的siRNA慢病毒载体,转染肝癌HepG2细胞系,经半定量RT-PCR鉴定筛选沉默效果最佳的细胞系,于倒置荧光显微镜(×400)下观察转染前后细胞的形态学变化。取细胞浓度为5×10⁶ mL^-1的干扰效率最佳的稳定转染细胞系、稳定转染空载体病毒细胞系及正常HepG2细胞系悬液各0.2 mL,分别注射到转染实验组、阴性对照组及空白对照组的裸鼠右腋皮下,每周测量肿瘤体积及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长曲线,28 d后处死裸鼠,制作肿瘤组织标本,行常规病理检查,采用半定量RT-PCR及Western-blot方法检测肿瘤组织Id-1,ERK1/2的mRNA和蛋白的表达水平及p-ERK1/2的蛋白表达水平。 结果 倒置荧光显微镜显示,转染前后细胞形态学变化不明显。经半定量RT-PCR筛选出Id-1基因的siRNA慢病毒载体的最佳细胞系为sh31,与稳定转染空载体病毒细胞系相比,目的基因Id-1的表达降低了80%以上,与未干扰的HepG2细胞相比降低了60%; 转染细胞皮下接种后,转染组最终瘤体大小明显小于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。半定量RT-PCR显示,转染组肿瘤组织的Id-1及ERK1/2 mRNA分别为(0.389±0.058)及(0.475±0.079),均明显低于阴性对照组[(0.845±0.113),(0.977±0.082)]和空白对照组[(0.917±0.083),(0.978±0.056)](均为P<0.05)。Western-blot检测显示,转染组的Id-1及p-ERK1/2蛋白均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。 结论 Id-1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体通过靶向抑制Id-1的表达,明显抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,推测Id-1可能通过调节ERK1/2 MAPK信号通路参与肝癌的发生发展。     

外源性野生型p53基因对HepG2细胞的作用

目的 研究外源性野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞生长的影响。方法 以人源性肝癌细胞系HepG2细胞为实验对象,检测其p53基因的突变。转染阳离子脂质体介导的野生型p53基因,检测其表达和凋亡水平的变化。结果 人源性肝癌细胞系HepG2细胞存在p53基因的突变,阳离子脂质体介导的野生型p53基因可有效转染入HepG2细胞中。转染后的HepG2细胞增殖受到抑制,细胞凋亡水平增高。结论 野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞有明显的抑制效应, 可能在肝癌的治疗方面起着重要作用。     

逆转录病毒介导PTEN基因抑制人肝癌细胞系的生长

目的 研究外源性PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径。方法 将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染HHCC细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究PTEN基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响。结果 稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞中PTEN蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降70．6％裸鼠致瘤能力抑制率72．2％。结论 转染外源性PTEN基因可阻止HHCC肝癌细胞由G1期进入S期，并抑制肿瘤细胞增殖。     

GPI-PLD过表达对肝癌细胞株HepG2生物学特征的影响

目的:研究GPI-PLD基因转染并过度表达对HepG2细胞的影响.方法:用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1( )/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1( )的细胞为对照,G418筛选出阳性细胞克隆.用自制具完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶为底物,定量检测GPI-PLD活性,RT-PCR法确定GPI-PLD mRNA表达水平.细胞计数绘制生长曲线,荧光染色观察HepG2细胞形态学改变,流式细胞术检测凋亡,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒(CDC)杀伤率,ELISA检测癌胚抗原(CEA)的表达情况.结果:阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约2倍,GPI-PLD mRNA表达水平约增加5倍;GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强,细胞呈现典型的凋亡形态特征,流式细胞术检测到凋亡峰,细胞凋亡率明显增加.结论:成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞,并在细胞中稳定表达.GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性.     

HBx基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2周期的影响

目的 探讨HBx基因通过调节miR-192的表达影响人肝癌细胞株HepG2周期进展的机制.方法 流式细胞仪分析以下3组细胞的周期变化:HepG2/HBx细胞(HepG2细胞稳定转染HBx基因)、HepG2/pcDNA3.1细胞(HepG2细胞稳定转染空载体pcDNA3.1)以及HepG2细胞.3组细胞中miR-192的...     

人HSC70基因真核表达载体的构建和表达

目的构建HSC70（HSC）真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法采用RT—RCR方法从正常人肝细胞系QZE中得到HSC70的cDNA序列，然后克隆入pcDNA^TM3．1／V5-His^A载体，构建重组质粒pcDNA-HSC70；经酶切和测序鉴定后，将pcDNA-HSC70体外转染HepG2细胞系，瞬时表达带有His标签的HSC70融合蛋白；并通过免疫细胞化学方法检测蛋白表达情况。结果RT—PCR扩增到1960bp的HSC70 cDNA片断，经测序分析与GenBank中已知序列一致；重组质粒pcDNA—HSC70转染后的HepG2细胞中，可检测到瞬时表达的HSC70-His融合蛋白。结论成功构建重组质粒pcDNA—HSC70，并可以在真核细胞HepG2中瞬时表达。     

肝细胞癌中 BTG2基因的表达及其对肝细胞癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的：研究肝细胞癌中BTG2基因的表达以及BTG2基因对肝细胞癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法荧光定量PCR测定47例肝细胞癌组织中BTG2基因的表达情况。构建表达载体pcDNA-BTG2,转染HepG2细胞。转染后,蛋白质印迹法检测转染后BTG2蛋白的表达,MTT法测定细胞生长抑制率,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,BTG2 mRNA在肝细胞癌组织中表达明显下调（P＜0．01）。且BTG2的表达与肝细胞癌的分级相关,随着分化程度的升高呈逐渐增加的趋势,但与肝细胞癌的分期及淋巴结转移、远处转移无关。转染表达载体pcDNA-BTG2能够显著上调HepG2细胞中BTG2蛋白的表达,同时,细胞生长抑制率及凋亡率明显增加（ P＜0．01）。结论在肝细胞癌中BTG2基因表达下调,其表达上调能够抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡。     

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1（＋）质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro

Chickenanemiavirus (CAV)isaparticulartypeviruswithadiameterofabout 2 3nmandcontainsacircularsinglestrandDNA (minusstrand)of 2 .3kb .ItwasfirstisolatedbyYuasaetalin 1979[1] ,andbelongstotherecentlyestablishedvirusfamilyofCircovirdae[2 ] .ExperimentsperformedbyNotebornetaldemonstratedthatCAVinducesdepletionofcellsviaapoptosisandthecellularbackgroundspeci fiesthesusceptibilitytoCAV[3] .Theinvitroexper imentsdemonstratedthatVP3isthefunctionalpro teinofCAV .AndtheCAVVP3proteincanonlyin du…     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

鸡贫血病毒VP 3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究

用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的vp3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建了重组体pcDNA-vp3.经酶切鉴定及测序分析表明,该片段和预期相符.在体外利用LipofectAMINETM介导的基因转染,将pc-DNA-vp3、pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2和二倍体肝细胞系L-02中,转染后的RT-PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达.同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法,证明了鸡贫血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡,并且只诱导癌细胞的凋亡,而不诱导正常或二倍体细胞死亡.表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂.