瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞周期分析及P53基因突变检测

目的：探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有生物学活性异常的成纤维细胞， 以期进一步了解瘢痕疙瘩的发展机制。方法：对所取新鲜组织标本进行细胞培养，通过碘化丙啶（PI）染色，激光流式细胞仪分析细胞周期，比较各组成纤维细胞处于增殖期细胞的百分比。采用PCR技术对P53基因外显子4、5、6进行扩增并测序。结果：瘢痕疙瘩周围皮肤增殖期成纤维细胞百分比与瘢痕疙瘩中央部相似（P＞0．05），介于瘢痕疙瘩边缘部与正常皮肤之间，与两者的差异均有显著性意义（P＜0．05）。所有体外培养瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞（6／6）均存在P53外显子4的点突变，3例（2／6）P53外显子5存在移码突变，均与同病人瘢痕疙瘩成纤维细胞基因突变一致，而两组正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变，结论：瘢痕疙瘩周围0.5cm皮肤内存在生物学活性异常成纤维细胞，这可能为瘢痕疙瘩浸润性生长的结果及其治疗后易复发的原因之一。     

蛋白糖基化抑制剂对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与功能的影响

目的 研究N-糖链合成抑制剂衣霉素对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与诱导凋亡功能的影响.方法 瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例,以健康皮肤为对照,免疫组织化学法检测组织中成纤维细胞Fas蛋白表达;组织块贴壁法培养成纤维细胞;Western Blot法及流式细胞术检测衣霉素处理及未处理各组成纤维细胞Fas蛋白水平的表达及凋亡率的变化.结果 病理性瘢痕及健康皮肤成纤维细胞胞质及胞膜中均可见Fas蛋白表达;增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平依次降低,3组成纤维细胞在Fas单克隆抗体(Fas monoelonal antibody,FasMcAb)作用后凋亡率与Fas蛋白糖基化成正相关,衣霉素可明显降低病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平,但对健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平抑制作用不明显.结论 FasMcAb诱导病理性瘢痕成纤维细胞凋亡与成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平成正相关,而衣霉素可显著降低成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平.     

瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变的研究

目的　探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞中 p5 3基因第 4～ 8外显子的突变规律及其意义。　方法　取瘢痕患者手术切除的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕标本各 12例 ,并设患者自身正常皮肤标本及血标本为对照。体外分离、培养上述组织标本的成纤维细胞。采用聚合酶链式反应 单链构象多态性(PCR SSCP)分析方法和基因测序法 ,检测各种组织成纤维细胞中p5 3基因的突变情况。　 结果　 12例瘢痕疙瘩标本中有 9例p5 3基因外显子 4、5、6、7出现点突变和移码突变 ,增生性瘢痕标本、正常皮肤标本及血标本中均未检出突变。　结论　p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

瘢痕疙瘩家系Fas基因死亡域突变的实验研究

目的 探讨瘢痕疙瘩家系标本中Fas基因（外显子7～9）有无突变以及Fas基因突变在瘢痕疙瘩形成中的意义。方法 实验标本来自南方医科大学南方医院整形外科2005年收集的A、B两个瘢痕疙瘩家系。采用PCR及基因测序技术，分别以A家系2例男性患者的瘢痕疙瘩组织为研究对象，以其周围正常皮肤及外周静脉血作为自身对照，其配偶的外周静脉血作为正常对照，并以B家系2例患者（母亲与儿子）的外周静脉血作为不同家系之间的对照，共检测10份标本中Fas基因外显子7～9基因序列。结果 10份瘢痕疙瘩家系标本Fas基因的7、8外显子均未发生突变，2例瘢痕疙瘩组织标本均在外显子9编码区的11bp和53bp两个位点上存在单个碱基基因突变或多态性改变。结论 瘢痕疙瘩Fas基因死亡域外显子9区段的基因结构异常，极有可能与Fas蛋白的功能改变有关，从而导致局部瘢痕疙瘩形成。     

瘢痕疙瘩p53基因突变高发区基因结构的研究

目的 探讨p53抑癌基因在病理性瘢痕组织中的结构异常与临床病理的关系。方法 采用PCR-SSCP及基因测序技术，以增生性瘢痕及正常皮肤为对照，检测瘢痕疙瘩组织标本p53基因突变高发区外显子4～6的基因结构。结果 瘢痕疙瘩p53基因外显子4、5、6均存在突变，对照组未发现突变。结论 提示瘢痕疙瘩p53基因抑制细胞进程及介导细胞凋亡等功能丧失。     

Fas介导下瘢痕成纤维细胞中死亡信号传导的研究

目的　研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗 (FasMcab)诱导产生凋亡的能力 ,同时探讨Ca2 、氢过氧化物 (LPO)在其相应死亡信号通道中的作用。方法　取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩患者的瘢痕及瘢痕疙者组织各 6例 ,通过细胞培养 6～ 8代后 ,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞 2 4h ,应用透射电镜证实凋亡现象的发生 ;应用流式细胞仪检测及比较两者凋亡率。同时 ,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca 2 、LPO的变化。结果　增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下 ,发生明显的凋亡现象 ,其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高。瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下 ,均未发现明显的凋亡 ,且各组间差异无显著意义。在FasM cab作用下 ,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2 、LPO显著增高 ,而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2 、LPO的变化差异无显著意义。结论　Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖～凋亡调控异常的细胞生物学机理之一。在FasMcab作用下 ,细胞内Ca2 、LPO产生的障碍可能直接导致瘢痕疙瘩的凋亡异常。     

Fas介导的病理性瘢痕成纤维细胞的凋亡及部分相关死亡信号递质的传递

目的研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经FasMcab(Fas单抗)诱导产生凋亡的能力,同时探讨Ca2+、H+在其相应死亡信号通道中的作用.方法取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各 6例,通过细胞培养6～8代后,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24小时,比较两者凋亡率.同时,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+ 、H+的变化.结果①增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下,随着单抗浓度的增高,其凋亡率不断增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下,均未发现明显的凋亡,且各组间无显著差异;③在FasMcab作用下,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化;④在Fa sMcab作用下,增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纤维细胞内H+均下降,两组间无显著的差异.结论①瘢痕疙瘩成纤维细胞有别于增生性瘢痕成纤维细胞,FasMcab 不能诱导其产生正常的凋亡.鉴于Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道,Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一 ;②Ca2+作为Fas信号通道中一种重要的下游信号通道介质,在Fas介导的病理性瘢痕成纤维细胞凋亡中起着重要作用;③H+参与了成纤维细胞内Fas信号的传递;但H+ 作为重要的信号递质,它的变化并非Fas介导成纤维细胞凋亡所必需的.     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子8突变序列分析

目的探讨Fas基因缺失在瘢痕疙瘩形成中的意义.方法采用PCR-SSCP银染技术及基因序列分析,检测15个瘢痕疙瘩标本Fas基因外显子8的基因结构.结果所检测的15个瘢痕疙瘩标本100%有Fas基因外显子8的杂合丢失,基因测序发现11个标本共4个位点存在基因突变.结论瘢痕疙瘩Fas基因外显子8的基因结构异常与其编码的蛋白无功能关系密切.     

瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的研究

目的　探讨瘢痕疙瘩的成纤维细胞的增殖和凋亡状态。方法　采用免疫组化和末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术 ,检测 2 4例瘢痕疙瘩和其周围正常皮肤中成纤维细胞的增殖和凋亡状态。以每 10个高倍镜(40 0倍 )视野中成纤维细胞凋亡及PCNA阳性细胞数与总细胞数之比作为凋亡指数和增殖指数 ,利用配对t检验进行统计学处理。结果　 2 4例瘢痕疙瘩成纤维细胞和对照组平均增殖指数、平均凋亡指数、平均凋亡指数 /平均增殖指数 ,经配对t检验具有高度显著性差别。结论　瘢痕疙瘩成纤维细胞的过量增生和凋亡相对减少在瘢痕疙瘩的发生和发展中起着重要作用。     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子8突变序列分析

目的 探讨Fas基因缺失在瘢痕疙瘩形成中的意义。方法 采用PCR—SSCP银染技术及基因序列分析，检测15个瘢痕疙瘩标本Fas基因外显子8的基因结构。结果 所检测的15个瘢痕疙瘩标本100％有Fas基因外显子8的杂合丢失，基因测序发现11个标本共4个位点存在基因突变。结论 瘢痕疙瘩Fas基因外显子8的基因结构异常与其编码的蛋白无功能关系密切。     

瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞分布特征及其增殖活性

目的：初步探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有异常成纤维细胞存在，以期为临床提供一个更为准确的治疗范围。方法：采用体外培养成纤维细胞技术比较瘢痕疙瘩及其周围皮肤与正常皮肤成纤维细胞的形态及分布特征，用MTT比色法比较其细胞增殖活性。结果：瘢痕疙瘩周围皮肤（距边缘0.5cm范围内）成纤维细胞形态与正常皮肤一致，但在其散在分布区域存在交错重叠生长现象，与瘢痕疙瘩相似。瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞增殖活性与瘢痕疙瘩中央部相似，介于瘢痕疙瘩边缘部与正常皮肤之间。结论：瘢痕疙瘩周围皮肤中存在生物活性异常的成纤维细胞。     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子6,8,9的突变分析

目的：研究瘢痕疙瘩Fas基因中外显子6，8，9的突变情况，了解该基因突变与瘢痕疙瘩形成之间的关系。方法：实验分正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织三组，采用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)方法筛选突变，然后进行序列分析以确定突变。结果：经银染SSCP分析，在23例瘢痕疙瘩标本中，出现异常电泳带的有18例，经测序，外显子6，8，9突变分别有8例、12例和7例，6和8同时存在突变的有2例，6和9同时存在突变的有3例，8和9同时存在突变的有2例，三个外显子同时有突变的有l例，而且发现了新的突变，在正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中均未检出突变。结论：瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系；PCR-SSCP是检测基因点突变的一种快速、敏感、有效的方法。     

瘢痕疙瘩组织p53基因突变的实验研究

目的：分析瘢痕疙瘩中p53基因第4—8外显子的突变及其意义。方法：取手术切除的瘢痕疙瘩和正常瘢痕各12例，并分别取同一患者正常皮肤对照，采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)和基因测序，检测各组织p53基因的突变情况。结果：12例瘢痕疙瘩标本中有9例p53基因外显子4、5、6、7出现点突变和移码突变，正常瘢痕标本、正常皮肤标本均未检出突变。结论：p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

多重PCR-SSCP检测人瘢痕疙瘩Fas基因突变

目的　建立多重PCR -SSCP反应体系 ,以筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变。方法　按照多重PCR引物设计原则设计相应引物 ,经分析、实验得到理想的多重PCR扩增条件 ,以此条件扩增目的基因 ;将所得PCR反应产物在单基因对照下进行银染多重SSCP分析 ,进而筛选基因突变。结果　外显子 6 ,8,9的单一PCR反应产物及多重PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳 ,各条带清晰 ,无非特异性扩增 ,且产量较高 ,产物的长度与理论值相符 ;经银染多重SSCP分析 ,正常皮肤组织和增生性瘢痕中均未检出突变 ,在 2 3例瘢痕疙瘩标本中 ,18例出现异常电泳带。结论　本实验建立了用以分析瘢痕疙瘩Fas基因突变的多重PCR -SSCP方法 ,分析结果提示 :瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系 ;多重PCR -SSCP是检测基因点突变的一种快速、敏感、有效的方法     

Expression of apoptosis-associated genes by human dermal scar fibroblasts

The purpose of this study was to determine if aberrant apoptosis plays a role in pathologic wound healing as manifested by hypertrophic scarring and keloid formation. Apoptosis has recently been found to participate in the transition between granulation tissue and the development of definitive scar. The question that remains to be answered is what stimuli initiate apoptosis during wound healing. Hitherto, regulatory factors and pathways involved have been largely undefined. We investigated heterogeneity among fibroblasts derived from normal skin and keloid scar, by examining apoptotic profiles and pathways for these cells. Quantitative analysis of apoptotic cells using an Annexin-V-FITC binding assay showed that normal skin fibroblast cultures were found to have a two-fold higher percentage of apoptotic cells than did keloid fibroblast cultures. To study apoptotic pathways and related death-associated genes, a ribonuclease protection assay was performed for fibroblasts exposed to anti-Fas antibody and tumor necrosis factor-alpha to activate the Fas/TNF receptor apoptotic pathway. Compared with normal skin fibroblasts, keloid fibroblasts exhibited decreased expression of apoptosis-associated genes.     

Fibronectin gene expression differs in normal and abnormal human wound healing

The overproduction of fibronectin and type I collagen in keloids and hypertrophic scars implicates altered regulation of extracellular matrix components as an important aspect of these wound healing pathologies. However, little is known about the similarities and differences in extracellular matrix gene expression during normal and abnormal wound healing. This study compared the content of fibronectin messenger RNA and rates of fibronectin protein biosynthesis in fibroblasts derived from normal skin, normal scar, keloid, and hypertrophic scar. Fibronectin expression was enhanced in cells from both normal and abnormal wounds relative to cells from quiescent normal skin. Matched pairs of normal and keloid fibroblasts from the same individuals were also compared, and three of the four pairs showed higher fibronectin expression by the keloid cells at the levels of messenger RNA and protein synthesis. This was consistent with previous studies showing elevated steady state content of fibronectin in keloid cells relative to normal cells from the same individual. Fibronectin messenger RNA and protein content in the tissues from which these cells were derived was examined by in situ hybridization and immunohistochemistry. These studies revealed that in vivo, the steady state content of fibronectin messenger RNA and protein was highest in abnormal wounds, less in most normal scars, and lowest in normal skin. Thus, fibroblasts from keloids and hypertrophic scars overexpressed fibronectin in vivo relative to normal skin and normal scar and retain this characteristic in vitro relative to normal skin. Although normal scars contained little fibronectin protein and messenger RNA, cultured fibroblasts derived from these scars had contents of fibronectin messenger RNA and rates of biosynthesis in vitro similar to those of keloid fibroblasts. This indicates that the fibronectin regulatory pathway in scar fibroblasts is influenced by the tissue environment. These results are discussed with respect to the relationship of fibronectin expression in keloids, hypertrophic scars, and normal wounds in human beings.