间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白在CHO细胞中的表达及其对耐药菌的作用

目的在CHO细胞中表达功能性BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白,检测该种抗菌蛋白对临床常见耐药性革兰阴性菌(G-菌)(大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌)的抑杀作用。方法用pSNAV-signal-syn BPIm600-Fcγ1700转染CHO-K1细胞,通过Dot blot筛选获得高表达BPIm23-Fcγ1目的蛋白的阳性细胞克隆,经PF-CHO培养基扩大培养,获得分泌表达的BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白。采用离子交换层析、Western blot和ELISA方法纯化、鉴定目的重组蛋白。采用微量细菌定量药敏试验法检测目的抗菌蛋白对耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的抑杀作用。结果获得了高表达BPIm23-Fcγ1目的重组蛋白的阳性细胞克隆,目的蛋白表达量约为25~50 mg/L。目的蛋白经Western blot和ELISA方法检测证实确为BPIm23-Fcγ1重组蛋白。该重组抗菌蛋白对耐药和非耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌具有同等抑杀作用。结论获得了功能性BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白,该重组蛋白(0.4 mg/L)能有效抑杀耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌。     

弓形虫致密颗粒蛋白的免疫反应性评价

目的对弓形虫的重组蛋白谷胱甘肽巯基转移酶致密颗粒蛋白(GSTGRA7)的免疫反应性进行评价。方法异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌BL21(pGEX4T1/GRA7)表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠(SDS)变性蛋白质电泳,分别以人抗弓形虫阳性血清和兔抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlotting分析。用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果重组蛋白GSTGRA7能被兔抗弓形虫阳性血清、人抗弓形虫阳性血清所识别。该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫重组蛋白GSTGRA7具有良好的免疫反应性。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达

目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET－32a（＋）／AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET－32a（＋）质粒和重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基．p—D．硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni抖金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。     

ELISA检测GFAP的临床意义

目的探讨出血性脑卒中和缺血性脑卒中患者血清中胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达以及对预后的影响。方法用ELISA方法检测出血性脑卒中和缺血性脑卒中患者和健康对照组外周中GFAP的表达水平,统计分析GFAP表达与脑卒中的进展及预后的关系。结果出血性脑卒中患者外周血GFAP表达水平显著高于缺血性脑卒中患者和正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论出血性脑卒中患者外周血GFAP表达水平高于缺血性脑卒中患者和正常对照组,且预后更差。     

急性脑梗死患者血清GFAP和TNF-α水平的动态变化研究

目的探讨胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在急性脑梗死患者发病中的作用及与脑梗死面积、神经功能缺损评分的关系。方法将我院收治的急性脑梗死患者58例作为患者组,在门诊健康查体的人群中随机选出55例年龄和性别相匹配的健康人作为对照组。应用ELISA方法连续测定急性脑梗死患者发病后3、7和14 d GFAP和TNF-α血清浓度。结果 GFAP和TNF-α血清水平在脑梗死发病第3、7和14天均高于对照组,并且高峰时间均在发病第7天。GFAP的血清浓度与梗死灶的大小、神经功能缺损程度有相关性,而TNF-α血清浓度与梗死灶大小、神经功能缺损程度无相关性。结论 GFAP和TNF-α血清水平在急性脑梗死患者中明显增高,表明GFAP和TNF-α参与了脑梗死早期的病理生理过程,可为临床上急性脑梗死的早期诊治提供依据。     

微创血肿清除术对脑出血患者血清胶质纤维酸性蛋白的影响

目的探讨微创血肿清除术对脑出血患者血清胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的影响。方法采用酶联免疫吸附法测定脑出血微创术患者74例、脑出血非手术患者80例发病后1（手术组术前）、3、7、14?d血清胶质纤维酸性蛋白含量,取60名健康查体者作为正常对照组,分析微创术对脑出血患者GFAP水平动态变化的影响。结果脑出血患者发病后各时间点血浆GFAP水平显著高于正常对照组(P均＜0.001), 手术组在第7、14天显著低于非手术组但仍明显高于对照组(P均＜0.001);两组脑出血患者第1、3、7、14天血清GFAP含量均与当天神经功能缺损评分（NDS）成正相关。结论微创术后血清GFAP 含量显著降低,可作为评价高血压性脑出血微创术治疗效果的生物学指标。     

帕金森病患者血清胶质纤维酸性蛋白的对照研究

目的探讨帕金森病患者血清胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的浓度变化及其临床意义。方法用ELISA法检测帕金森病组（23例）、健康对照组（29例）和急性脑梗死组（30例）共82例受试者血清GFAP含量并进行比较。帕金森病组根据病程又分为两组，即病程〈5年组和病程≥5年组，了解帕金森病患者病程和年龄对血清GFAP含量的影响。结果帕金森病组、急性脑梗死组血清GFAP含量[分别为（1．628±0．104）μg/L，（1．637±0．063）μg／L]较健康对照组[（0．025±0．003）μg／L]明显升高（t值分别为82．7，143．2，均P〈0．05），而帕金森病组和急性脑梗死组血清GFAP含量差异无统计学意义（t=0．214，P〉0．05）。帕金森病组血清GFAP含量和年龄无相关性，帕金森病患者不同病程组间血清GFAP含量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论帕金森病患者血清中GFAP含量明显增加，但没有疾病特异性，随病程的延长帕金森病患者血清GFAP含量保持一定水平，提示星形胶质细胞在疾病过程中的作用持续存在。     

ALS小鼠脊髓组织GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰

目的 探讨肌萎缩脊髓硬化症(ALS)模型小鼠脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)中赖氨酸的乙酰化修饰。方法 对4个月左右的ALS模型小鼠进行麻醉处死,提取小鼠脊髓组织总蛋白,通过GFAP抗体和乙酰化抗体,运用免疫沉淀和免疫蛋白印迹技术鉴定GFAP蛋白的表达与GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰,通过液相二级质谱连用(LC-MS/MS)检测ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP赖氨酸的乙酰化修饰位点。结果 免疫沉淀和免疫蛋白印迹方法发现ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP蛋白存在赖氨酸乙酰化修饰;LC-MS/MS发现GFAP的394位和402位赖氨酸位点发生乙酰化修饰。结论 ALS小鼠模型脊髓组织中,GFAP的赖氨酸位点能被乙酰化修饰,该修饰可能参与了ALS的发生。     

血浆胶质纤维酸性蛋白浓度对老年腹部手术后谵妄的预测价值

目的：探讨血浆胶质纤维酸性蛋白（GFAP）浓度对老年腹部手术术后谵妄（PD）的预测价值。方法选取全身麻醉下腹部手术治疗的老年患者（病例组）及同期健康体检老年人（对照组）各212例,采用ELISA法检测对照组体检时和病例组患者麻醉结束时、离开麻醉后恢复室（PACU）时、术后24、72h时血浆GFAP浓度,分析其对老年腹部手术PD的预测价值。结果病例组麻醉结束时、离开PACU时、术后24、72h时血浆GFAP浓度均较对照组显著升高（均P＜0.01）。logistic回归分析显示,麻醉结束时血浆GFAP浓度（OR=1.361,95%CI=1.125-2.109,P＜0.01）和年龄（OR=1.743,95%CI=1.242-3.352,P＜0.01）是老年腹部手术患者PD发生的独立危险因素。ROC曲线分析显示,麻醉结束时血浆GFAP浓度预测PD发生有显著预测价值（曲线下面积=0.872,95%CI=0.820-0.914,P＜0.01）,且判定血浆GFAP浓度＞19.9pg/ml对预测PD发生的灵敏度为75.0%、特异度80.2%。麻醉结束时血浆GFAP浓度的曲线下面积与离开PACU时和术后24h血浆GFAP浓度的曲线下面积的差异均无统计学意义（均P＞0.05）,而显著大于术后72h血浆GFAP浓度的曲线下面积（P＜0.01）。结论老年腹部手术PD患者血浆GFAP浓度明显升高,检测血浆GFAP有助于早期判断PD的发生。     

去甲二氢愈创木酸对SHG-44胶质瘤细胞GFAP基因表达的影响

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞分化过程中中对GFAP基因表达的影响及其意义。方法：用免疫组织化学和原位杂交方法定性、定量检测人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞GFAP基因的表达水平。结果：NDGA处理后,瘤细胞GFAP蛋白及mRNA表达水平明显增高（P＜0.01）。结论：NDGA具有诱导恶性胶质瘤细胞GFAP基因表达的作用,推测GFAP基因表达上调可能是NDGA诱导胶质瘤细胞分化的作用机制之一。     

反义GFAP对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5增殖及分化的影响

目的观察抑制内源性胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为进一步深入研究GFAP基因在胶质瘤恶性转化及诱导分化治疗中的作用提供实验基础.方法构建反义GFAP 逆转录病毒表达载体,经包装后以病毒上清感染人恶性胶质瘤细胞系CHG-5;采用RT-PCR、原位杂交以及免疫细胞化学方法检测GFAP基因及其蛋白的表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察抑制GFAP基因表达后CHG-5细胞形态、增殖和细胞周期进程的变化.结果反义逆病毒感染后CHG-5细胞GFAP mRNA及其蛋白表达显著减弱甚至缺失,瘤细胞异型性增加,细胞增殖速度加快,体外成瘤能力增强,S期、G2/M期细胞比例升高.结论抑制内源性GFAP基因表达可使CHG-5细胞呈现更为恶性的表型,提示GFAP基因在调控胶质瘤细胞分化程度及恶性生物学行为方面具有重要作用.     

胶质细胞对Aβ诱导的阿尔茨海默病大鼠脑神经损伤的影响

目的：探讨神经胶质细胞对β‐淀粉样蛋白（Aβ）诱导的阿尔茨海默病（AD）大鼠脑神经损伤的作用。方法将雄性Wistar大鼠20只,分为对照组和模型组,每组10只;模型组双侧海马注射凝胶态Aβ（10μg）,对照组注射生理盐水;行水迷宫实验;硫堇染色观察皮层神经元形态变化及数量;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）、白细胞介素‐1β（IL‐1β）水平;免疫组化检测胶质细胞及神经胶质原纤维酸性蛋白质（GFAP）表达。结果模型组大鼠水迷宫各项指标均明显低于对照组（P＜0．05）;皮层神经元数量较对照组明显减少（P＜0．01）;血清中TNF‐α、IL‐1β明显高于对照组（P＜0．05）;海马GFAP阳性细胞数明显多于对照组（P＜0．05）。结论Aβ可激活胶质细胞及促炎因子释放,引起大鼠脑神经元损伤,导致大鼠学习、记忆能力降低。     

涎腺肿瘤组织发生学的探讨

目的研究胶质纤维酸性蛋白在涎腺肿瘤中分布规律，并与波形丝蛋白、细胞角蛋白和Ｓ－１００蛋白的分布规律进行比较，以探讨涎腺肿瘤组织发生学。方法免疫组化ＡＢＣ法。结果在正常涎腺中，肌上皮细胞呈胶质纤维酸性蛋白阴性反应。在紧邻肿瘤或已受癌浸润的腺体中，围绕着闰管和萎缩的腺泡外围有层扁平的细胞，它们呈胶质纤维酸性蛋白阳性。在多形性腺瘤中，导管双层结构的外层瘤细胞、肿瘤性肌上皮细胞、粘液样细胞和软骨样细胞均呈胶质纤维酸性蛋白阳性反应。胶质纤维酸性蛋白还见于腺样囊性癌和乳头状囊腺癌癌巢的基底部。这些细胞同时表达波形丝蛋白、细胞角蛋白和Ｓ－１００蛋白。结论涎腺肿瘤可能起源于涎腺闰管的基底细胞，该基底细胞可能与神经外胚层关系密切。