人脐血间充质干细胞的培养条件比较

目的摸索人脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）的培养条件。方法根据不同采血量、首次换液时间、胎龄、不同培养基对样本分组，比较不同培养条件对脐血中的间充质干细胞原代生长的影响，以流式细胞仪对培养出的间充质干细胞进行细胞表面标志检测。结果在相同条件下，取10ml的脐血能较大程度培养出间充质干细胞；观察首次换液时间在培养后96h较为合适，延长换液时间有利于数量不占优势的单核细胞充分贴壁：早产胎儿的脐血培养出的间充质干细胞成功率较高；胎牛血清的质和量决定了培养成功与否。培养出的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志（CD34、CD45、CD14）及内皮细胞的标志（CD106），强表达CD29、CD44、CD13。结论样本量、首次换液时间、胎龄、培养基的质和量对MSCs的成活、生长有关键作用。     

不同浓度EGF对人脐血间充质干细胞增殖的研究

目的探索不同浓度表皮生长因子（EGF）对人脐血间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）增殖的影响。方法无菌条件下来集正常人脐血，密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，用Mesencult培养基进行纯化和扩增培养，通过MTT法检测不同浓度的EGF的促人脐血MSCs增殖作用。结果EGF的5—100ng／ml各浓度组增殖效应均明显大于对照组（P〈0．05），10ng／ml组明显大于其它各浓度组（P〈0．01）。结论EGF对体外培养的人脐血MSCs有促进增殖的作用，此作用呈剂量依赖性。     

人脐血间充质干细胞的分离与纯化

目的:探讨人脐血间充质干细胞(MSC)的培养纯化条件。方法:比较不同的梯度离心速度及时间、接种密度、首次换液时间、不同培养基对脐血中的MSC分离及原代培养过程的影响,以流式细胞仪对优化条件下培养的MSC进行细胞周期分析,并对细胞表面标志进行检测。结果:在其他条件不变的情况下,以1 000g×15 min的梯度离心速度及时间分离脐血为最宜,5×106/mL是脐血MSC培养的适宜接种密度,首次换液时间7 d。优化条件下培养的MSC传至3代时,几乎全部强表达CD29、CD44。结论:建立了一种优化的人脐血MSC分离纯化方法。     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC）,探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血,分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC,采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形,第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性,而CD34及CD45阴性。诱导6周后,联合诱导组无变化,而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型,并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周,检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外,阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

人脐血间充质干细胞分离培养的研究进展

干细胞是一类具有自我复制能力和产生分化细胞能力的细胞,分为胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于成体干细胞的一种,来源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层,最早在骨髓（bone marrow,BM）中被发现。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

脐血间充质干细胞向肝细胞分化的研究进展

随着对脐血干细胞的不断认识，研究者们发现脐血中含有丰富的造血干细胞。自1988年Gluckman等首次报道脐血移植治疗范科尼病以来，脐血移植已成为治疗恶性及非恶性血液系统疾病的重要方法之一。脐血干细胞的研究得到了人们的重视，世界各地已经建立了许多脐血库。2000年Erices等通过研究发现脐血中还存在有在细胞形态、免疫表型及功能特点方面与骨髓间充质干细胞相似的一类同质细胞群。自此脐血间充质干细胞（umbilical cord blood-mesenchyrmal stem cell，UCB-MSC）引起广泛关注。同时关于UBC-MSC分化能力的研究也逐步展开，现对脐血间充质干细胞及其向肝细胞的分化作一综述。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的改良

目的探讨一种新的能提高脐血间充质干细胞体外分离培养成功率的方法。方法利用Ficoil分离脐血,采用改良的密度梯度两步离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20％胎牛血清和5％人脐血血清的原代培养液中,在倒置相差显微镜下进行形态观察,直接免疫荧光法检测人脐血间充质干细胞相关抗原CD29的表达。加入成骨诱导剂体外诱导脐血间充质干细胞10d碱性磷酸酶染色鉴定其成骨分化能力。结果本实验方法成功分离培养出人脐血间充质干细胞。原代培养第4天即可见到有成纤维样细胞贴壁,10d左右集落形成,约25d进行传代。传代后生长加速,一周左右即可长满,免疫荧光检测显示脐血间充质干细胞相关抗原CD29呈阳性表达,成骨诱导10d碱性磷酸酶染色阳性。结论利用改良的密度梯度离心法可获得人脐血间充质干细胞．     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。     

人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定

目的对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞。方法抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析。结果脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHCⅡ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能。结论可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞。     

脐血间质干细胞肌源性诱导后细胞生理变化

目的探讨5-氮胞苷(5-aza)、心肌细胞裂解液和心肌诱导液等三种肌源性诱导方法对脐血间质干细胞(MSCs)生理性质的影响。方法MSCs以密度梯度离心法取自足月妊娠犬,免疫组化检测细胞表面抗原,经5-aza、心肌细胞裂解液和心肌诱导液诱导后,Western blotting检测心肌转录因子Nkx2.5的表达,膜片钳检测细胞动作电位,激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2 浓度的变化。结果MSCs表达CD29和CD71,不表达CD11a、CD11b和CD34;诱导后三组细胞均有Nkx2.5的表达,5-aza和心肌细胞裂解液诱导后的细胞可检测到动作电位,三组细胞胞内Ca2 浓度不同。结论肌源性诱导后的MSCs只部分具有心肌细胞的生理特性,功能上与心肌细胞的差异仍较为显著。     

血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响。方法将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中。每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率。结果脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况最好,在不含血清的L-DMEM中生长状况最差。结论含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的最佳培养基。     

人脐带间充质干细胞辅助的异种脂肪移植的实验研究

目的：探讨脐带间充质干细胞在体内辅助游离移植脂肪组织的可行性。方法：组织块法培养人脐带间充质干细胞,与大鼠脂肪混合移植至大鼠背部皮下,对照组未添加细胞单纯脂肪移植。移植后6个月取材,通过组织观察、HE染色及免疫组化进行分析。结果：组织块法可获取脐带间充质干细胞,组织移植6个月后取材,实验组与对照组在体积及重量上差异无统计学意义。 HE染色两组也未见差异,免疫组化可见特异性对抗人GAPDH反应阳性细胞存在。结论：以异种脐带间充质干细胞辅助游离移植脂肪组织与单纯脂肪移植无差异,脐带间充质干细胞辅助游离移植脂肪组织有待进一步研究。     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?