中波紫外线对体外培养的人黑色素细胞的影响

目的：研究紫外线对人黑色素细胞的影响,以探讨日光在人皮肤老化中的作用。方法：采用MTT法测定细胞的增殖,NaOH法测定黑素含量,Takahashi法测定格氨酸酶活性。结果：中波紫外线照射后,细胞增殖明显（P＜0．05）,黑素含量增加（P＜0．01）,酪氨酸酶活性提高（P＜0．05）。结论：中波紫外线使暴露局部皮肤色素沉着明显,加速皮肤老化过程。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

培养在壳聚糖-明胶膜片材料上人黑色素细胞的生物学特性初步研究

目的 研究培养在壳聚糖-明胶膜片材料上黑色素细胞的生物学特性.方法 取幼儿包皮,酶消化成单细胞悬液,接种后在黑色素细胞条件培养液中静置培养.黑色素细胞纯化、扩增后接种于壳聚糖-明胶膜片上.定期观察细胞形态变化及生长增殖情况,应用MTT测定、黑色素瘤抗体(Melan-A)免疫荧光染色、DOPA反应以判断黑色素细胞在壳聚糖-明胶膜片上的增殖及分化情况.结果 分离、纯化的黑色素细胞接种于壳聚糖-明胶膜片上生长良好,Melan-A免疫荧光染色及DOPA反应为阳性.结论 壳聚糖-明胶膜片是支持人黑色素细胞生长的良好材料,这一体系为色素脱失症的治疗提供了新的途径.     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性

目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（adipose derived stem/stromal cells,ASCs）,对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。方法：将腹部取皮术的皮下脂肪利用胶原酶消化法,进行体外分离培养,取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、流式鉴定、MTT、细胞周期检测等,利用成脂和成骨培养液诱导,油红O和茜素红染色鉴定诱导结果。结果：原代培养第1次换液时细胞多呈多角形和短梭形,第3代ASCs细胞爬片HE染色显示形态多为长梭形,呈漩涡状生长;流式鉴定显示：CD29＋,CD31-,CD34-,CD44＋,CD45-,CD49＋,CD106-,CD133-;MTT显示ASCs生长增殖活性强;细胞周期检测结果显示：G1=86.8%,G2=8.77%;成脂诱导后油红O染色阳性,对照组为阴性;成骨诱导后茜素红染色阳性,对照组为阴性。结论：人ASCs具有贴壁生长、多向分化以及干细胞表型等特征,且生长增殖活性强,是一种很有应用前景的间充质干细胞。     

小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及电镜观察

我们在成功分离培养鼠神经干细胞的基础上[1,2 ] ,对神经干细胞的生长发育特性进行电镜观察。一、材料与方法1.材料 :一级昆明E12 13孕小鼠(本校动物中心提供 ) ,改良的Eagle培养液 (DMEM /F12 ) ,胎牛血清 ,表皮生长因子 (EGF) ,均购于Gibco公司 ;N 2添加剂 (N2 supplement)、Nestin抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)抗体、神经丝蛋白 2 0 0 (NF 2 0 0 )抗体 ,购自Sigma公司 ;免疫组织化学检测系统购自博士德公司。透射电子显微镜 (日立 F75型 )。2 .细胞的分离培养及传代 :无菌条件下剖腹取胎鼠 ,在解剖显微镜下分离胎鼠大脑半…     

退行性变黄韧带细胞的体外培养及初步鉴定

目的：探讨黄韧带退变的发生机理。方法：采用组织块培养法，体外培养正常黄韧带和退变性黄韧带细胞．并进行细胞化学、免疫细胞化学等方面研究。结果：黄韧带细胞可以在体外增殖和传代，退变性黄韧带细胞呈现出某些成骨细胞表型特征，而正常黄韧带细胞主要为成纤维细胞表型。结论：退变黄韧带中存在大量具备某些成骨细胞表型特征的细胞，其中包括软骨细胞，它们可能被骨形成蛋白等骨生长因子所调控。     

人黑素细胞的体外培养与观察

目的：探讨人黑素细胞体外培养方法。方法：采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和霍乱毒素（CT）协同培养，在例置显微镜下观察其形态和生长率，并采用L-DOPA和S-100染色进行鉴定。结果：在原代培24-28小时，可见典型的多极树突状细胞，随着培养时间的延长，细胞以双极或/和三极为主，胞内充满黑素颗粒，L-DOPA和S-100染色阳性。结论：bFGF/CT协同培养为一种相对比较安全、稳定的黑素细胞培养系统，可用于实验研究。     

构建含黑色素细胞组织工程表皮的实验研究

目的将黑色素细胞和表皮角质形成细胞，接种于壳聚糖-明胶薄膜材料上，构建含黑色素细胞的组织工程表皮。方法从小儿包皮分离黑色素细胞和表皮角质形成细胞，分别对黑色素细胞和表皮角质形成细胞进行鉴定，并进行不同代次细胞生长动力学检测。将黑色素细胞和表皮角质形成细胞接种于壳聚糖-明胶薄膜上，进一步检测两种细胞在材料上的生长情况。结果分离培养黑色素细胞和表皮角质形成细胞，经鉴定两者分别表达S-100和角蛋白。接种于壳聚糖-明胶薄膜上的黑色素细胞和表皮角质形成细胞能成功构建组织工程化表皮替代物。两种细胞在材料上生长状态良好，分布均匀，并表达各自特异性标志物。结论以壳聚糖-明胶薄膜材料作为支架材料，成体黑色素细胞和表皮角质形成细胞为种子细胞，能有效地构建含黑色素细胞的组织工程表皮。     

成人表皮干细胞和汗腺细胞的体外分离和培养

背景：人表皮干细胞和汗腺细胞的分离培养及鉴定,为探讨人表皮干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探讨体外分离培养人表皮干细胞及汗腺细胞的有效方法。方法：采集不同年龄段的泌尿外科患者术后包皮组织,充分清洗消毒后去除皮下组织,将其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片,用Ⅳ型胶原纯化、富集成人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态：使用免疫荧光染色对成人表皮干细胞表型进行分析;CCK-8检测细胞的增殖曲线;采用胶原酶消化法从人全层无损伤皮肤中分离提取汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果：倒置相差显微镜下见分离培养的成人表皮干细胞呈卵圆形、细胞之间紧密相连,呈铺路石状,免疫荧光染色显示细胞表达CK19、β1整合素。倒置相差显微镜下见汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞标志细胞CK7、18、19及CEA。结论：本实验结果说明胶原酶消化法分离培养成人表皮干细胞及汗腺样细胞是可行的。     

骨细胞的体外分离培养及鉴定

目的 建立较稳定的实验室骨细胞分离培养方法.方法 采用序列酶消化法,从3 d龄Sprague-Dawley乳鼠颅骨中分离骨细胞,通过形态学、改良钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色和免疫细胞化学法骨钙素(BGP)染色来鉴定骨细胞.结果 细胞形态呈星状、有树状突起,ALP染色阴性,BGP染色阳性,说明分离出的细胞为骨细胞.结论 本实验结果为在体外深入研究骨细胞的功能提供实验手段.     

成骨细胞体外培养技术

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,对它的研究成为研究骨代谢和成骨机制的重要途径。选择便捷高效的体外培养方法,是开展体外成骨细胞研究的前提。随着细胞培养技术的发展,人们已经通过分离培养、诱导分化、与破骨细胞共培养乃至建立3D共培养体系,从许多动物的骨组织中成功培养或者诱导形成具有典型成骨特性的细胞。本文就常见的成骨细胞体外培养技术和鉴定方法做简要概述。     

猪跟腱止点纤维软骨细胞的分离、体外培养及鉴定

[目的]探讨猪跟腱止点纤维软骨层细胞的分离、培养及鉴定方法,观察纤维软骨细胞的生物学特性。[方法]体视显微镜下切取贵州迷你小香猪跟腱止点纤维软骨层组织并剪碎,经过胰蛋白酶和II型胶原酶两步酶消法,后在含10%FBS的DMEM进行培养和传代,使用HE、阿利新蓝、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。[结果]成功分离获得纤维软骨细胞。鉴定证实实验细胞具有纤维软骨细胞共同生物学特性。HE染色:细胞浆蛋白多糖成分被染成深浅不同的粉红色;阿利新蓝染色:纤维软骨细胞内见蓝紫色异染颗粒,细胞核深染,细胞周围有少量异染颗粒出现。Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:纤维软骨细胞胞质被染成棕黄色。[结论]成功分离和培养了猪跟腱止点纤维软骨层细胞,针对纤维软骨细胞特性,通过不同染色方法进行了联合鉴定。本实验建立的腱止点纤维软骨细胞分离、培养方法是一种简便可靠的方法。     

胚胎干细胞体外诱导分化为黑色素细胞的研究进展

胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESs）是从早期胚胎内细胞团（Inner cell mass,ICM）或桑椹胚中分离出的高度未分化的全能细胞。ES细胞体外诱导分化为黑色素细胞的过程能更明确皮肤黑色素细胞和视网膜黑色素上皮细胞（Retinal pigmented epithelium,RPE）的基因选择性表达程序。     

人成骨细胞体外培养、鉴定及护骨素表达的研究

目的：用酶消化法从正常人松质骨中分离成骨细胞，进行体外培养和功能鉴定，观察用17β－雌二醇（17β-E2）和雌激素受体拮抗剂ICI182780处理后，成骨细胞中护骨素（OPG）的表达变化。方法：用胰酶－胶原酶消化法从正常人松骨骨中分离培养成骨细胞，Ⅰ型胶原染色用VanGie-son法，钙化结节用茜素红染色，用钙钴法显示成骨细胞中碱性磷酸酶的表达，骨钙素和OPG基因的表达用RT－PCR检测，OPG蛋白用W esternBlot检测，结果：用酶消化法分离的人成骨细胞，在体外培养时可维持合成Ⅰ型胶原，碱性磷酸酶、骨钙素，并形成钙化结节等功能，体外培养的人成骨细胞表达OPG，17β-E2上调其表达，并能被雌激素受体拮抗剂ICI182780阻断。结论：用酶消化法进行人成骨细胞培养，方便易行，可培养大量高纯度人成骨细胞供研究使用；17β-E2上调OPC表达，而绝经后雌激素缺乏时，OPG的表达相应减少，可能是骨质疏松的发病因素之一。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 体外观察大鼠骨髓间充质干细胞的基本生物学特性,建立rMSCs的分离培养方法,为诱导分化成肌研究打下基础.方法 采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs.观察细胞的形态和生长特性,倍增时间,生长曲线,用流式细胞仪分析rMSCs的表面抗原.结果 体外培养的rMSCs很快贴壁.4～8d即贴壁80%,细胞增殖迅速,7d左右即可达到80%融合.流式细胞仪分析CD90、CD13、CD44表达强阳性,CD14、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,符合MSCs的表面抗原特征.结论 经Percoll密度梯度离心法获得的rMSCs细胞株较纯,可作为组织工程中的种子细胞来源,但大鼠MSCs在体外培养过程中易于衰老.     

破骨细胞体外培养技术

由于破骨细胞在骨质疏松及相关疾病中的关键作用,对它的研究成为攻克这些疾病的必由之路。选择便捷高效的体外培养方法,是开展体外破骨细胞研究的前提。破骨细胞是终末分化细胞,不能增殖传代,因此破骨细胞的体外培养一直是一个具有挑战性的难题。本文就常见的破骨细胞体外培养技术和鉴定方法做简要概述。     

小鼠骨髓来源树突状细胞的体外培养及鉴定

我们采用改良Inaba法从骨髓前体细胞中诱导、扩增树突状细胞(DC),并对其根据形态和表型特征进行鉴定. 一、材料与方法 1.实验动物:6～8周龄雄性C57BL/6小鼠购自武汉大学实验动物中心,合格证号鄂00001292.     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。