反式HDV核酶对肝癌细胞端粒酶活性抑制的研究

目的 观察HDV核酶是否能有效切割肝癌细胞端粒酶组分及在细胞内使端粒酶活性抑制。方法 设计合成针对端粒酶组分的HDV核酶的序列，构建该核酶的体外转录和真核表达质粒，测定HDV核酶对端粒酶的体外切割效力和在细胞内对端粒酶活性的抑制。结果 HDV核酶对底物的最大体外剪切效率为70％。导入细胞后，使端粒酶活性下降90％。结论H DV核酶(g．RZ57)对人肝癌细胞端粒酶活性有抑制作用，可望成为新型的肿瘤抑制剂。     

针对端粒酶的HDV核酶的设计及其对端粒酶活性抑制研究

设计针对端粒酶的HDV核酶，观察其对端粒酶活性抑制。设计和合成了针对端粒酶组分的HDV核酶的序列，构建了该核酶的体外转录和真核表达质粒，检测了HDV核酶对端粒酶组分的体外切割效力和对端粒酶活性的抑制作用。核酶对底物的最大剪切效率为70．4％。导入细胞后，使端粒酶活性下降90％。HDV核酶(g．RZ57)对端粒酶活性有抑制作用，可望成为有效的肿瘤治疗抑制剂。     

茜草蒽醌对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用及分子机制

目的探讨茜草提取物蒽醌单体对人SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用及分子机制。方法将茜草蒽醌作用于体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞，采用MTY法检测其对肝癌细胞生长的抑制作用，应用TRAP-PAGE银染半定量法和RT—PCR半定量法检测端粒酶活性及端粒酶亚单位即端粒酶相关蛋白1（TP1）基因、端粒酶RNA（hTR）基因、端粒酶催化亚单位（hTERT）基因变化。结果茜草蒽醌能抑制肝癌细胞的生长，呈现与浓度、时间的依赖趋势；降低端粒酶活性，使hTERT基因的表达量明显下降（P〈0．01），而hTR、TP1基因的表达无显著变化（P〉0．05）。结论茜草蒽醌能显著抑制肝癌细胞的生长并抑制端粒酶的活性，可能与其下调hTERT基因的表达有关。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株端粒酶活性作用的实验研究

观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的作用。用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与肝癌细胞株共同孵育一定时间后,观察细胞形态变化、细胞DNA含量的发布,测定端粒酶活性。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在G1期前出现亚2倍体凋亡峰;端粒酶活性抑制,端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒合成,从而抑制肝癌细胞的生长。     

鼠移植性肝癌内注射乙酸的治疗实验

目的观察３００ｍＬ／Ｌ乙酸局部注射治疗裸鼠移植瘤的效果,并探讨其作用机制．方法应用人肝癌（ｈＨＣＣ）细胞悬液接种于Ｂａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕ裸鼠皮下建立移植瘤模型共１２只,分为３组,乙酸组５只注射３００ｍＬ／Ｌ乙酸０１５ｍＬ,乙醇组５只注射无水乙醇０１５ｍＬ,盐水组２只注射生理盐水０１５ｍＬ,２次／ｗｋ,共４次．观察移植瘤生长情况．结果乙酸组移植瘤全部结痂、脱落,而乙醇组除一只裸鼠移植瘤结痂、脱落外其余均明显缩小（Ｐ＜００５）,盐水组移植瘤呈结节样进行性生长．病理学检查：乙酸组可见纤维组织未见肝癌细胞,乙醇组除大片组织坏死外可见散在的肝癌细胞团,盐水组肝癌细胞生长良好．结论３００ｍＬ／Ｌ乙酸较无水乙醇能产生更广泛的组织坏死,可以代替无水乙醇局部注射治疗ｈＨＣＣ．     

抗癌新靶点：端粒及端粒酶抑制剂研究进展

端粒酶在绝大多数恶性肿瘤中特异性表达，这使得人们对肿瘤的抗端粒酶疗法产生了特别的关注．设想以端粒、端粒酶为靶点，通过抑制癌细胞端粒酶活性或直接抑制端粒延长、稳定，而使细胞无法连续增殖，继而进入衰老途径，直至死亡．同时端粒、端粒酶在肿瘤细胞与正常体组织...     

端粒酶与肝癌

肝癌组织中端粒酶阳性表达率80％以上,正常肝组织中无端粒酶活性表达,肝炎、肝硬化组织中有不同程度的表达率,但其活性明显较肝癌组织低,端粒酶活性检查可以帮助早期诊断分化良好的肝细胞癌,有望成为肝癌早期诊断的标志物,端粒酶活性水平与细胞的分化有关,影响肿瘤的生长和复发,端粒酶活性水平检测也有助于判断肝癌复发的危险,针对端粒酶进行肿瘤治疗可能有重要意义。     

人端粒酶催化亚单位锤头状核酶诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染入肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况。 方法 用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核表达质粒pGTRz-U6及其突变体pGTmRz-U6,并以空质粒pEGFP-C1作为对照。Lipofectamine2000转染人肝癌细胞株SMMC7721,G418筛选阳性克隆。RT-PCR检测核酶及hTERT基因的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)作细胞生长曲线观察其生长情况,TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,流式细胞计数(FCM)法检测细胞的凋亡水平。 结果 核酶、突变核酶在SMMC7721中持续表达;凝胶成像系统分析SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT基因表达,用SPSS10.0软件对3种细胞进行分析,发现三者hTERT基因表达水平不同(F=47.987,P<0.01);t检验分析得出SMMC7721-Rz hTERT基因表达明显低于SMMC7721-mRz和SMMC7721- pEGFP-C1(t值分别为-7.640和-11.602,P值均<0.01)。SMMC7721-pEGFP-C1和SMMC7721-mRz hTERT表达没有区别(t=-0.178,P>0.05)。TRAP-银染及FCM结果分别显示,随着细胞的分裂,SMMC7721-Rz和SMMC7721-mRz细胞端粒酶活性逐渐降低,凋亡水平逐渐增加,7PDS细胞凋亡率分别是29.86％和9.87％,而对照组SMMC     

肝癌组织及外周血单核细胞端粒酶异常对肝癌诊断价值的研究

目的探讨肝癌组织及外周血单核细胞中端粒酶表达对肝癌诊断的临床价值。方法以0.05%2-乙基氨基芴(2-FAA)饲料饲养SD大鼠诱发肝癌发生,在肝细胞癌变过程中观察端粒酶的动态变化及与总RNA的关系。并从人肝癌和非癌组织中制备总RNA,采用端粒重复扩增法-ELISA分析肝组织及外周血单核细胞端粒酶活性及其对肝癌的诊断与鉴别价值。结果经大鼠诱癌后,在肝细胞经细胞变性、癌前病变和肝癌形成的过程中,肝内总RNA和端粒酶显著表达,并呈正相关关系(r=0.83,P<0.01);在人肝癌组端粒酶活性明显高于它的非癌组织,而总RNA则是非癌组明显高于癌组;外周血单核细胞中,癌组端粒酶活性明显高于肝硬化组、慢性肝炎组及正常对照(P<0.01);外周血AFP浓度与单核细胞端粒酶活性联合分析,对肝癌具有互补诊断价值。结论肝癌发生过程中端粒酶表达异常,外周血中端粒酶活性检测有助于肝癌的诊断及预后观察。     

核酶对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的定量观察双位点核酶对细胞内ＨＢＶ基因表达的抑制作用。方法构建针对ＨＢＶＣ区双位点核酶的真核表达载体（ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ）,将该质粒与ｐｌ．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人肝细胞癌（ＨＨＣＣ）细胞株,对转染细胞所表达ＨＢｅＡｇ进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。结果共转染细胞可以表达ＨＢｅＡｇ,同对照组相比,核酶组荧光量明显下降。结论在核酶与ＨＢＶ共转染细胞中,核酶通过对ＨＢＶｍＲＮＡ的剪切作用,使ＨＢｅＡｇ的表达量明显受到抑制。     

Antitumor immunity induced by DNA vaccine encoding alpha-fetoprotein／heat shock protein 70

AIM:To construct a DNA vaccine encoding human alpha-fetoprotein (hAFP)/heat shock protein 70 (HSP70), and to study its ability to induce specific CTL response and its protective effect against AFP-expressing tumor.METHODS: A DNA vaccine was constructed by combiningh AFP gene with HSP70 gene. SP2/0 cells were stably transfected with pBBS212-hAFP and pBBS212-hAFP/HSP70 eukaryotic expression vectors. Mice were primed and boosted with DNA vaccine hAFP/HSP70 by intramuscular injection, whereas plasmid with hAFP or HSP70 was used as controls. ELISPOT and ELISA were used to detect IFN-γ-producing splenocytes and the level of serum anti-AFP antibody from immunized mice respectively. In vivo tumor challenge was measured to assess the immune effect of the DNA vaccine.RESULTS: By DNA vaccine immunization, the results of ELISPOT and ELISA showed that the number of IFN-γ-producing splenocytes and the level of serum anti-AFP antibody were significantly higher in rhAFP/HSP70 group than in hAFP and empty plasmid groups (95.50&#177;10.90 IFN-γ spots/10^6 cells vs 23.60&#177;11.80 IFN-γ spots/10^6 cells,7.17&#177;4.24 IFN-γ spots/106 cells, P&lt;0.01; 126.50&#177;8.22μg/mL vs 51.72&#177;3.40μg/mL, 5.83&#177;3.79μg/mL, P&lt;0.01). The tumor volume in rhAFP/HSP70 group was significantly smaller than that in pBBS212-hAFP and empty plasmid groups (37.41&#177;7.34 mm^3 vs 381.13&#177;15.48 mm^3, 817.51&#177;16.25 mm^3,P&lt;0.01). CONCLUSION: Sequential immunization with a recombinant DNA vaccine encoding AFP and heat shock protein70 could generate effective AFP-specific T cell responses and induce definite antitumor effects on AFP-producing tumors, which may be suitable for some clinical testing as a vaccine for HCC.     

U1小核核糖核酸嵌合体核酶细胞内抑制丙型肝炎病毒表达的研究

目的观察以U1小核核糖核酸为靶向基因构建的嵌合体核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒（HCV）表达的作用。方法通过聚合酶链反应及克隆连接反应，将针对HCV核心区的特异性核酶序列代替了U1小核RNA的部分区域，构建出嵌合体核酶的真核表达载体；将其与带有荧光素酶报告基因的靶基因共转染Huh7细胞系，通过Western blot及发光检测仪来判定抑制效率并与相同序列核酶的效率进行比较。结果U1-嵌合体核酶构建成功；共转染结果显示核酶及嵌合体核酶对HCV表达均有抑制作用，但以嵌合体核酶的效率为高。结论以U1小核核糖核酸作为核酶载体可以增加核酶在细胞内的切割活性。     

C-Met信号阻断对肝癌细胞生长和运动能力的影响

目的 用合成的c-Met反义寡核苷酸链,构建的c—Met反义质粒及U1SnRNA/核酶/反义c-Met复合体来封闭c-Met信号传导,探讨c-Met信号传导阻滞对肝癌生长和转移的影响。方法 以脂质体法将c-Met反义质粒、U 1SnRNA/核酶/反义c—Met复合体转染肝癌SF7721细胞,分别用四甲基偶氮唑蓝、生长曲线、穿膜试验观察转染前后细胞的变化。将转染前后细胞分别接种裸鼠,观察移植瘤生长及转移情况。结果c-Met反义寡核苷酸链能抑制肝癌SF7721细胞的增殖,t=3.58,P< 0.05,c-Met反义核酸质粒及U1SnRNA/核酶/反义c-Met复合体质粒转染后细胞表达受体c—Met的量均减少,且转染后细胞增殖明显减慢,为对照组的50％,F=4.87,P<0.05,侵袭运动能力减弱。初步动物实验显示转染后细胞生长较慢,潜伏期延长,35 d后反义(6.37 g)与核酶(6.14 g)实验组肿瘤生长明显低于对照组(11.01g),F=5.17,P<0.05。结论 c-Met受体基因表达在肝癌生长转移中起重要作用,阻断c-Met—SF的信号传导降低肿瘤生长甚至转移的能力。     

脂质体法转染人肿瘤坏死因子-α基因对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制效应及其机制

背景：外源性肿瘤坏死因子（TNF）-α联合化疗药物对肿瘤的疗效较单独应用更佳,为肿瘤治疗提供了新的方向。目的：对裸鼠人肝癌移植瘤模型行脂质体介导的TNF-α基因瘤内转染,研究肝癌移植瘤的生长抑制情况及其机制。方法：经脂质体介导,以真核表达质粒pSVK3-TNF-α分别转染人肝癌细胞株SMMC-7721和裸鼠皮下SMMC-7721细胞移植瘤。测定SMMC-7721细胞的TNF-α浓度,甲基噻唑基四唑（MTT）法测定细胞杀伤率,流式细胞仪和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞周期和凋亡情况。结果：TNF-α转基因治疗裸鼠人肝癌移植瘤结束第5d,移植瘤体积为（75.28±35.35）mm^3,显著低于对照组的（326.45±103.64）mm^3（P〈0.05）。TNF-α基因体外转染SMMC-7721细胞24、48、72h后,基因转染组每106个细胞的TNF-α表达量分别为（1680±187）pg、（1702±205）pg和（1650±164）pg,细胞杀伤率分别为（37.1±2.4）%、（79.4±4.3）%和（84.2±4.6）%。基因转染72h后,SMMC-7721细胞增殖指数为（30.5±3.2）%,显著低于对照组的（46.1±3.9）%（P〈0.05）;凋亡指数为（10.0±2.1）%,显著高于对照组的（2.7±0.4）%（P〈0.01）。结论：脂质体介导的TNF-α基因转染裸鼠人肝癌移植瘤可明显抑制肿瘤生长,其机制可能为影响肿瘤细胞生长周期以及诱导肿瘤细胞凋亡。     

抗Caspase-3核酶的体外制备与活性鉴定

目的 研究针对大鼠凋亡基因Caspase-3设计的核酶（Rz107和Rz544）的体外转录,切割及活性鉴定。方法 大鼠Caspase-3基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游,32^P标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成并克隆针对大鼠Caspase-3 mRNA的核酶（Rz107和Rz544）,32^P标记转录,核酶与靶RNA按一定比例进行体外切割实验。结果 Rz107在37℃有活性。在一定温度范围内,其切割效率随温度升高而升高,最适温度为50℃。其米氏常数（km）为14.13mol/L,酶催化反应速度常数（kcat）为2.31/min。而Rz544则无切割活力。结论 体外制备的Rz107具有良好的特异催化切割活性,它有望通过切割（Caspase-3)而抑制凋亡发生,可发展为新一代抗肝炎症的核酸药物。     

重组人内皮抑素腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤生长

目的 观察重组人内皮抑素腺病毒(Ad/hEndo)对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法 人脐静脉内皮细胞ECV-304经Ad/hEndo感染后,western印迹检测人内皮抑素的表达。人肝癌BEL-7402细胞移植到裸鼠背脊部后,检测Ad/hEndo对肝癌移植瘤生长的抑制作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中内皮抑素mRNA的表达。分析人内皮抑素在裸鼠体内的表达分布。结果 Western印迹检测到人内皮抑素基因在ECV-304细胞内高效表达。Ad/hEndo明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤生长(F=4.061,P<0.05)。Ad/hEndo组血管密度计数为6.88±1.08,DMEM组为13.60±1.71(t=9.216,P<0.01)。瘤内注射Ad/hEndo后3d,RT-PCR在肿瘤组织检测到内皮抑素mRNA的表达,7d后表达不明显。人内皮抑素蛋白主要分布在肿瘤组织。结论 腺病毒介导的人内皮抑素基因在体内、体外获得高效表达,并明显抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长与血管生成。     

Telomerase antagonists GRN163 and GRN163L inhibit tumor growth and increase chemosensitivity of human hepatoma

Most cancer cells have an immortal growth capacity as a consequence of telomerase reactivation. Inhibition of this enzyme leads to increased telomere dysfunction, which limits the proliferative capacity of tumor cells; thus, telomerase inhibition represents a potentially safe and universal target for cancer treatment. We evaluated the potential of two thio-phosphoramidate oligonucleotide inhibitors of telomerase, GRN163 and GRN163L, as drug candidates for the treatment of human hepatoma. GRN163 and GRN163L were tested in preclinical studies using systemic administration to treat flank xenografts of different human hepatoma cell lines (Hep3B and Huh7) in nude mice. The studies showed that both GRN163 and GRN163L inhibited telomerase activity and tumor cell growth in a dose-dependent manner in vitro and in vivo. The potency and efficacy of the lipid-conjugated antagonist, GRN163L, was superior to the nonlipidated parent compound, GRN163. Impaired tumor growth in vivo was associated with critical telomere shortening, induction of telomere dysfunction, reduced rate of cell proliferation, and increased apoptosis in the treatment groups. In vitro, GRN163L administration led to higher prevalence of chromosomal telomere-free ends and DNA damage foci in both hepatoma cell lines. In addition, in vitro chemosensitivity assay showed that pretreatment with GRN163L increased doxorubicin sensitivity of Hep3B. In conclusion, our data support the development of GRN163L, a novel lipidated conjugate of the telomerase inhibitor GRN163, for systemic treatment of human hepatoma. In addition to limiting the proliferative capacity of hepatoma, GRN163L might also increase the sensitivity of this tumor type to conventional chemotherapy.