抗肝癌免疫纳米颗粒的制备及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:制备抗肝癌单链抗体二聚体高分子免疫纳米颗粒,观察其对肝癌细胞增殖的影响.方法:采用离子交联的方法,以壳聚糖水溶性衍生物多糖为基材,将已获得的抗肝癌单链抗体二聚体BDM制备成免疫纳米颗粒,检测纳米颗粒的表征、包封率及载药量,并通过MTT法观察免疫纳米颗粒对肝癌细胞株增殖的影响.结果:制备粒径为100-200nm的抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,最佳包封率为53%,栽药量为75μg/mg抗体二聚体,抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒显示较好的抗肿瘤作用,其对肝癌细胞的抑制率为34%左右,且有浓度依赖性.结论:成功制备了抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,初步应用具有抑瘤性,为下一步开展体内肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础.     

抗肝癌单链免疫毒素的构建、表达及导向研究

目的 制备高效、低毒的抗肝癌单链免疫毒素。 方法 将人突变型肿瘤坏死因子α(mTNF α)与人源化抗肝癌单链抗体hscFv25基因连接,构建pGEx4T-1/hscFv25-mTNF α融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化目的蛋白,经western blot鉴定之后,进行荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠体内初步抑瘤实验,并对治疗后裸鼠肿瘤组织进行抗TNF α的免疫组织化学染色。 结果 原核表达载体pGEX4T-1/hscFv25 mTNF α融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的12％,hscFv25-mTNFα治疗组对荷肝癌裸鼠的有效率为5/5,其中2/5为完全缓解,3/5为部分缓解,疗效明显高于mTNFα对照组(F=8.70,P<0.05),治疗组裸鼠的肝、肺等组织中未见转移性病灶,经hscFv25-mTNFα治疗后的肿瘤组织,呈TNFα弥漫阳性反应,阳性颗粒主要位于瘤细胞的胞质中。 结论 hscFv25-mTNFα是高效、低毒的抗肝癌单链免疫毒素。     

抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定

目的采用重组抗原从人源化单链抗体库(Human single fold scFv library)中筛选和鉴定抗弓形虫主要表面抗原1(rSAG1)的单链抗体,对其特异性的弓形虫靶向作用进行分析,为弓形虫靶向生物治疗提供靶向分子。方法以重组SAG1融合蛋白作为包被抗原对噬菌体抗体库进行3轮固相筛选,获得抗rSAG1融合蛋白的阳性克隆;用纯化的原核表达载体pET-32C的亲和标签(Trx-His-Stag)、鼠可溶性抗原和大肠杆菌抗原对上述阳性克隆进行差异筛选,获得能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆;差异筛选获得的特异性阳性克隆转染大肠杆菌HB2151进行诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,获得能分泌抗rSAG1单链抗体(anti-rSAG1scFv)的阳性噬菌体克隆;DNA测序分析抗rSAG1的单链抗体基因序列。用Ni2 螯合柱亲和纯化rSAG1单链抗体,并用免疫印迹技术(Westernblot)对纯化的抗rSAG1单链抗体进行免疫反应性检测;免疫组化检测rSAG1单链抗体对弓形虫速殖子的靶向作用。结果经过rSAG1抗原的固相筛选后获得24株阳性克隆,差异筛选后获得5株能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆,其中有3株分泌性表达抗rSAG1的单链抗体,DNA测序和Genbank比对表明其为3株不同的抗弓形虫主要表面抗原1的单链抗体;West-ernblot表明亲和纯化的单链抗体能较好结合rSAG1;免疫组化显示抗rSAG1单链抗体可与弓形虫速殖子结合。结论利用噬菌体抗体库技术获得的特异性人源rSAG1单链抗体与弓形虫速殖子有较强的结合能力,这对弓形虫的靶向生物治疗具有潜在应用价值。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。     

人血清反应因子基因的原核表达及鸡卵黄多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达人血清反应因子(serum response factor,SRF)基因,制备鸡卵黄抗SRF抗体并鉴定其特性.方法 构建SRF表达载体PGEX-T-2-SRF,并在大肠杆菌中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经谷胱甘肽-S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行鉴定.用纯化的SRF免疫海蓝白母鸡,制备鸡抗SRF抗体.抗体的效价及特异性用蛋白质印迹技术进行测定和分析,免疫荧光鉴定其在心肌细胞中的定位.结果 构建的重组质粒PGEX-4T-2-SRF在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清液中,纯化的SRF经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的SRF免疫制备了鸡抗SRF抗体.蛋白质印迹技术结果表明,该抗体可与原核表达的SRF特异性结合,抗体效价为1:5000.免疫荧光证实该抗体可以和心肌细胞的细胞核特异性结合.结论 在原核细胞中表达了SRF制备的鸡抗SRF的抗体对SRF能进行特异性结合.     

弓形虫微线体蛋白MIC2和M2AP真核表达载体的构建

目的构建弓形虫RH株微线体蛋白M2AP和MIC2的真核表达载pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为建立同时表达MIC2和M2AP蛋白的重组毕赤酵母表达系统,制备重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP奠定基础。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,用Oligo dT-Adaptor引物逆转录合成cDNA。根据已知的弓形虫mic2和m2ap基因序列,采用引物设计软件Primer premier5.0自行设计并合成引物,以cDNA为模板,PCR扩增mic2和m2ap基因,克隆入pMD-19-simple-T载体,经酶切和测序鉴定后回收目的片段,分别插入至pGAPZαA内,构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,转化入E.coli DH5α。提取转化菌质粒,进行酶切和测序鉴定。结果 PCR扩增得到的mic2和m2ap基因分别为2 200bp和1 000bp,与预期大小一致。T-A克隆重组质粒pMD19-T-mic2、pMD19-T-m2ap和重组酵母表达质粒pGAPZαA-mic2、pGAPZαA-m2ap经测序鉴定,与GenBank收录的弓形虫mic2基因和m2ap基因序列同源性为100%,重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap构建成功。结论成功构建弓形虫重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为进一步研究MIC2和M2AP相互作用机制及其免疫保护效应奠定了基础。     

鼠抗人肥大细胞羧肽酶截短体抗体的制备与鉴定

目的 建立检测人肥大细胞羧肽酶(hMCCP)的双抗体夹心ELISA法,以hMCCP截短体免疫小鼠,制备鼠源性多克隆抗体.方法 PCR法扩增hMCCP-N118基因片段,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌Rosseta(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用Ni2 -NTA凝胶亲和层析纯化目的 蛋白.用纯化重组蛋白免疫小鼠,制备抗hMCCP-N118抗体.间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 hMCCP截短体在大肠杆菌中高效表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗hMCCP-N118抗体,效价达1∶6 400,该抗体能特异结合hMCCP.结论 成功地制备了效价高、特异性好的鼠抗hMCCP截短体抗体.     

重组人抗乙型肝炎表面抗体表达的研究

目的 应用毕赤酵母表达体系,表达、制备人抗乙型肝炎表面抗原全分子抗体.方法 以抗-HBs抗体阳性个体为对象构建抗体表达文库,筛选抗-HBs抗体轻链和重链可变区序列,并将其重组至同一表达载体pPICZαIgG,转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选鉴定及免疫印迹分析.结果 Western印迹检测在分子量约140 kD处出现特异性染色条带,ELISA结果表明所获得抗体分子具有良好的乙型肝炎表面抗原结合活性.结论 在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具抗原结合活性的完整分泌型抗-HBs抗体.     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

抗肝癌单链抗体融合人突变型TNFα的构建与表达

目的鼠/人源化抗人肝癌单链抗体(m/hscFv25)融合人突变型TNFα(mTNFα)原核表达载体的构建及表达.方法用Oligo软件分析并设计人mTNFα的5及3端引物,化学合成并用PCR方法扩增mTNFα,经限制性内切酶酶切后,连接在原核表达载体pGEX4T-1中的m/hscFv25之后,构建成pGEX4T-1/m/hscFv25-mTNFα融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌JM109后,通过IPTG诱导进行目的蛋白的初步表达.结果经DNA电泳分析表明,mTNFα基因全长约460 bp,并通过酶切鉴定证明成功构建了抗人肝癌单链抗体融合mTNFα的原核表达载体,融合蛋白产物经SDS-PAGE显示,相对分子质量(Mr)为68 000的蛋白谱带,与预期设计完全一致,光密度扫描结果表明,GST-mscFv25-mTNFα和GST-hscFv25-mTNFα融合蛋白分别占菌体总蛋白的15%和12%,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在.结论成功构建并表达了鼠/人源化抗人肝癌单链抗体融合人mTNFα的双功能抗体基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研究HCC的治疗奠定了基础.