基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。     

一种核酸适配体高敏检测方法的建立及应用评价

本文建立一种基于免疫印迹的核酸适配体高敏定量分析的检测方法,并探讨其在适配体药物靶向性研究中的应用价值。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行核酸适配体的分离,然后利用电转的方法将凝胶上的核酸适配体转移至PVDF膜上,先后孵育Rabbit Anti-Biotin和HRP-Streptavidin抗体,最后利用化学发光仪进行成像。结果显示核酸适配体可以通过该方法进行定量检测分析,且该方法检测灵敏度高,能够识别荧光染料法检测不到的浓度范围。此外,该方法只识别被生物素修饰的核酸适配体,特异性强。结果提示,核酸免疫印记法可以作为核酸适配体药物靶向性研究的一个定量检测手段。     

核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术体外筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地结合氨基酸、糖类、蛋白质、细胞、细菌和病毒等多种目标物质,具有操作简单、灵敏度高和检测成本低等优点.在海洋生物毒素的检测和预防中,核酸适配体技术已显示出巨大的潜力.本文概述了核酸适配体技术的基本原理、目前的应用现状及优势,分析了海洋生物毒素分子的特点及现有检测手段的局限,并对核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用前景进行了展望.     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

基于核酸适配体的比率荧光探针定量检测血浆外泌体

目的:建立一种新型比率荧光探针法用于定量检测血浆中外泌体。方法:将Cy5荧光探针标记的CD63核酸适配体固定到链霉亲和素磁珠(MNPs)上,得到MNPs-Apt,加入SYBR GreenⅠ(SGⅠ)核酸染料构建比率荧光免疫磁珠(MNPs-Apt-SGⅠ)。当外泌体存在时,CD63核酸适配体捕获外泌体而发生结构改变,SGⅠ探针从双链中释放,免疫磁珠上的SGⅠ荧光强度大幅减弱,而Cy5荧光探针的荧光恒定,根据两种荧光探针被激发的荧光信号比值变化[Δ(F_C/F_S)]对外泌体进行定量检测。结果:外泌体浓度在8.0×10⁴～1.0×10⁷个/μL范围内,Δ(F_C/F_S)与外泌体浓度呈良好的线性关系。该方法灵敏度高,选择性好,检出限为4.0×10⁴个/μL。此外,所建立的方法成功地应用于血浆外泌体的检测。结论:构建的比率荧光探针法具有快速、灵敏、准确度高、特异性强等优点,可用于血浆样品外泌体的定量检测。     

荧光原位杂交技术及其在医学中的应用

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhydridization，FISH）是一种崭新的生物学技术．是利用非放射性标记核酸代替放射性标记核酸在染色体、细胞或组织切片上进行原位杂交，借助免疫细胞化学（immunocytochemistry）过程以荧光信号对杂交体（hubrids）加以检测和定位的方法。由于该方法具有安全、灵敏、快速、高效和分辨率高等优点，所以发展异常迅速，应用非常广泛。本文就此作一介绍。一FISH的原理同源互补的核酸（可以是DNA或mRNA）变性后，在适当的条件下，能退火、复性重新成为双链结构。如果被检测的靶标（DNA或mRNA）与所用核…     

TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用研究

目的 探讨TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用.方法 制备马来酰亚胺修饰的装载阿霉素的脂质体(liposome),合成FITC荧光及巯基修饰的TLS9a核酸适配体,并将其耦联到脂质体表面.紫外分光光度法检测阿霉素包封率.动态光散射法(DLS)测纳米粒子粒径大小及电位分布,倒置荧光显微镜观察小鼠肝癌细胞对阿霉素摄入及用流式细胞技术检测平均荧光强度,评估小鼠肝癌细胞对药物摄入量.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性.结果 流式细胞术检测TLS9a核酸适配体与BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌细胞结合率为54.1％,TLS9a耦联的脂质体平均粒径分布在(116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的环境中可以快速释放化疗药物DOX,72 h药物释放量超过70％.TLS9a-liposome/DOX在体外能够有效抑制小鼠肝癌细胞BN L.1ME.A.7R.1生长.结论 TLS9a核酸适配体可以特异性与小鼠肝癌细胞BNL.1ME.A.7R.1结合,可用于检测小鼠肝癌细胞.     

非标记型适配体传感器对石房蛤毒素的高灵敏度检测

目的 建立了一种基于荧光染料噻唑橙(thiazole orange,TO)和核酸适配体的非标记型适配体传感器,可快速、灵敏地检测石房蛤毒素(saxitoxin,STX)。方法 本研究中使用经过变形处理的直链适配体 45e-1能够特异性识别并结合STX,形成了稳定的G-四链体复合物。TO自身以游离态存在于水溶液中时几乎没有荧光发射,但通过与G-四链体的小凹槽结合产生荧光。因此,TO可作为荧光探针,用于指示45e-1与STX结合后产生的构象变化从而达到定量检测STX的目的。 结果 在最佳实验条件下,荧光信号强度变化与STX浓度呈正相关关系,拟合线性方程为Y = 3639.8lgCon_STX + 2341.5(R₂ = 0.9725),检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略。在海水中,该方法的加标回收率为90.7%–108.7%,RSD为7.1%–10.9%。结论 本研究建立的非标记型适配体传感器可以实现对STX的定量检测,并且具有良好的特异性和重现性,为准确、快速检测其他海洋毒素提供思路。     

重组 PBP2a 转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的：筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a（PBP2a）转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,以重组 PBP2a 转肽酶区蛋白为靶标,从单链 DNA 文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链 DNA 文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组 PBP2a 蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用 SELEX 技术成功筛选出特异性结合重组 PBP2a 转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。     

金属纳米团簇荧光探针联合新型纳米材料在核酸检测领域中的应用现状

核酸检测技术在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。金属纳米团簇(MNCs)荧光探针是一种具有极大应用潜力的荧光探针，最常用的有银纳米团簇(Ag NCs)荧光探针和铜纳米团簇(Cu NCs)荧光探针，可用于检测DNA和miRNA。新型纳米材料，如氧化石墨烯、纳米碳氧化物、金纳米颗粒、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号。利用新型纳米材料对单链DNA和双链DNA的吸附能力具有巨大差异的特性，可设计出“turn on”型检测平台。此外，将新型纳米材料如二氧化硅纳米颗粒、磁性微球等，与MNCs荧光探针联用时，可获得荧光放大效应。本文总结了近年来在核酸检测方面MNCs荧光探针与纳米材料联用的各种检测平台，分析这些MNCs荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等，为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。     

鼻咽癌核酸适配子的筛选及鉴定

目的利用指数富集的配套系统进化技术(SELEX)筛选人类疱疹病毒(EB病毒)阳性鼻咽癌细胞核酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,通过SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮的筛选,克隆、测序,并对适配子进行鉴定。结果流式细胞仪检测亚文库与靶细胞的结合能力随着筛选轮数的增加荧光强度增强。聚类分析显示,适配子可以分为3个家族,1、2家族具有保守序列。结论初步建立EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库,筛选到具有亲和力和特异性的核酸适配子。     

核酸适配体对岩沙海葵毒素细胞毒性保护作用

目的 核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地与靶标分子结合。岩沙海葵毒素（Palytoxin,PLTX）是目前已知的最具毒性的非蛋白质类天然海洋毒素之一。基于核酸适配体对PLTX的特异性靶向功能,探究核酸适配体对细胞毒性的保护作用。方法 采用细胞毒性实验分别检测比较了PLTX对NIH-3T3、CHO-K1、HACAT三种不同细胞的毒性作用,以及适配体拮抗PLTX的细胞毒作用。采用红细胞溶血实验检测PLTX对人红细胞的溶血作用,以及适配体抑制PLTX的溶血活性作用。结果 三种细胞毒性曲线结果显示,HACAT细胞的ID50约为3.42ng/ml,CHO-K1细胞的ID50约为1.06×10-2ng/ml,NIH-3T3细胞的ID50约为1.39×10-2ng/ml。在不同浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对HACAT细胞的毒性作用（P<0.05）。在50nM PLTX浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对人红细胞溶血活性作用（P<0.05）。结论 实验结果表明HACAT细胞对2.5×10-3~2.5×102ng/ml浓度范围的PLTX毒性作用较敏感;核酸适配体对HACAT细胞具有细胞毒性保护作用。在50nM PLTX浓度下,相应浓度适配体能够有效抑制PLTX对人红细胞的溶血活性,起到显著细胞保护作用。     

基于CRISPR-Cas12a系统反式切割活性的凝血酶检测技术研究

目的：通过构建快速、灵敏的凝血酶检测技术,为多种血管栓塞性疾病,如脑静脉窦血栓形成（cerebral venous sinus thrombosis,CVST）的早期诊断和治疗提供新的策略。方法：利用所筛选的高特异性凝血酶适配体设计发夹结构变构探针,用于高特异性识别凝血酶并将凝血酶信号转化为核酸信号。在变构探针识别凝血酶后,适配体结合凝血酶引发变构探针变构,暴露Cas12a活性部分。CRISPR-Cas12a系统识别活性部分后,其反式切割特性被触发,开始无序切割周围存在的单链DNA荧光探针,导致标记在荧光探针两端的荧光基团（Cy3）和淬灭基团（BHQ）分离,使处于被淬灭状态的Cy3荧光重新出现。所产生的荧光信号的强度与体系中存在的凝血酶浓度呈正相关。结果：通过荧光实验证实所设计的变构探针对凝血酶表现出极高的识别特异性和稳定性;在所优化的实验条件下,该方法表现出良好的检测性能,检测限为0.23 pmol/L。结论：该方法结合了高灵敏度、低成本和良好的便携性等优点,为凝血酶相关疾病的检测与精准诊断提供了强有力的技术支持。     

荧光染料SYBR GreenⅠ及EB在定量PCR中敏感性比较

目的比较荧光染料SYBR Green I及EB在定量PCR诊断中检测DNA的敏感性.方法分别用琼脂糖凝胶电泳SYBR Green I染色及EB染色,检测26例21-三体综合征患者及20例正常人DNA PCR扩增产物,并进行光密度分析比较.结果SYBR Green I染色于24个循环PCR产物带型清楚,可准确定量检测;EB染色则在28个循环才能进行定量分析.结论荧光染料SYBR Green I染色较EB染色测量DNA敏感、快捷,在定量PCR技术中值得推广应用.     

核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用

肿瘤的液体活检（CTCs、ctDNA和外泌体）可以提供全面、动态的病理信息,对肿瘤的早期诊疗、疗效监测和复发监控有重要作用,但在检测的灵敏度和特异性方面需要改进。而核酸适配体具有独特的空间构象,易于合成,能够进行特定的修饰与组装,能够放大检测信号,因此核酸适配体在肿瘤液体活检的应用中具有广阔的前景。本文对核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用作一综述。     

两种碘化丙啶染色 DNA 定量方法检测 HL-60细胞凋亡结果的比较

碘化丙啶(propidium iodide,PI)是插入性核酸染料,直接插入双链核酸的2个碱基对之间,每5个碱基插入1个荧光分子,与核酸的结合均匀、稳定。细胞经过 RNA 酶处理后,PI 可以与细胞内 DNA 特异性结合,在流式细胞仪上经488 nm 激光激发,发出峰值610~620 nm 的荧光,可以准确的反映细胞群体中DNA 含量的分布情况,适用于 DNA 定量检测。根据细胞周期中不同时项 DNA 的变化来检测细胞周期中DNA 合成前期( G0/ G1期)、 DNA 合成期( S 期)与DNA 合成后期(G2期)各时项的细胞比例。因为 PI是适用于所有流式细胞仪的染料,这一染色技术在临床肿瘤诊断和医学科研中被普遍的采用,常规使用的染色方法是包括固定、RNA 酶处理、PI 饱和染色3个关键步骤的3步法 PI 染色技术[1]。在一些研究中,当细胞在生理或病理条件下发生了凋亡,DNA 损伤,细胞内 DNA 降低,也可以采用3步法 PI 染色检测亚 G1峰(也称作凋亡峰),用于凋亡细胞比例和特征的分析[2]。但是在实际应用中,由于凋亡时相的不同,当凋亡细胞中 DNA 损伤部分没有完全脱出细胞时,往往检测不到明确可辨的亚 G1峰,敏感度较低。作为细胞凋亡检测的经典方法之一的彗星检测[3],以细胞在电泳移动中 DNA 的迁移形态作为凋亡的特征指标,此技术中比较关键的一步即采用碱性高渗试剂使凋亡细胞中断裂的 DNA 碎片脱出细胞,从而在电泳迁移中呈现出彗星尾样的拖痕,本课题组利用类似方法,用高渗缓冲液作用于固定后的悬浮细胞,使凋亡细胞内断裂 DNA 较彻底的脱出细胞外,再进行 DNA定量检测,提高对细胞凋亡的识别度和敏感性[4]。     

适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展

核酸适配体是一类能特异性地靶向特定抗原的单链寡聚核苷酸。较之常用的抗体等靶头向性配体,适配体体积相对较小、免疫原性较低且易于体外筛选。目前,以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统通常有3类：第1类将适配体修饰于脂质体、纳米粒、胶束等纳米载体上,形成适配体靶向的纳米载体;第2类直接将适配体与药物/荧光物质相连,形成适配体-药物/荧光物质共轭物;第3类将适配体自身作为药物的靶向载体。本文就近期以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展进行概述。     

三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较

目的 探讨补镁对高脂高糖膳食诱导大鼠肥胖模型形成的影响及作用机制.使用染胶法、染样品法及后染法比较溴化乙锭(FB)与3种新型核酸染料GoldViewna Ⅱ、GoldView及DNA Green染色DNA的灵敏度.方法 在琼脂糖凝胶电泳中,分别在3种染色方式下使用4种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色,观察并分析电泳结果.结果 核酸染料比较结果:GoldViewna Ⅱ的灵敏度最高,DNA Green的灵敏度与EB相当,GoldView的灵敏度略低于EB.染色方式比较结果:使用染胶法的灵敏度最高,后染法次之,染样品法最低.结论 三种新型核酸染料完全可以替代EB,用于琼脂糖凝胶电泳DNA染色.使用新型核酸染料建议采用染胶法染色DNA.     

氮化碳纳米片耦合适配体的赭曲霉毒素荧光检测新方法研究

目的建立快速测定药材外源性有害成分赭曲霉毒素（OTA）的含量,为药材快速质控技术提供前期基础。方法制定一段一端标记有羧基荧光素（FAM）荧光团的赭曲霉毒素DNA适配体序列片段:5’-GAT-CGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-FAM-3’,在20 mM Tris-HCl缓冲液（包含100 mM NaCl、5.0mM KCl、5.0 mM MgCl2,pH 7.4）中,以氮化碳纳米片（g-C3N4nanosheets,CNNS）为荧光淬灭基质,利用CNNS对游离态DNA和OTA-DNA复合态的吸附差异和其对FAM的荧光淬灭作用,实现对OTA的检测。结果该传感器对OTA的检测线性范围为1～100 nM,检测限为0.7 nM,且10倍浓度的赭曲霉毒素B和黄曲霉毒素B1均不会对检测结果有明显影响。结论氮化碳纳米片耦合OTA适配体的荧光检测方法具有较高的选择性和灵敏度,且操作简单,有望成为中药材中赭曲霉毒素含量测定的新方法。     

基于核酸适配体技术对清开灵注射液中胆酸的研究

目的利用免疫磁珠分离技术和核酸适配体相结合的方法剔除清开灵注射液中胆酸小分子,借此研究胆酸在清开灵注射液对细胞脱颗粒中的作用。方法将标记有生物素的胆酸的核酸适配体与表面有链霉亲和素包被的磁珠偶联,然后将偶联物与清开灵注射液进行孵育,使胆酸与核酸适配体特异结合,最后利用磁性分离将清开灵注射液中的胆酸剔除。对胆酸剔除前后的清开灵注射液进行细胞脱颗粒实验,以研究其类过敏反应的性质。结果磁珠与适配体的偶联反应具有浓度依懒性。适配体剔除清开灵注射液中的胆酸也具有浓度依懒性。剔除部分胆酸后的清开灵注射液对细胞的脱颗粒作用,与清开灵注射液相比,有显著下降。结论利用胆酸的核酸适配体与免疫磁珠分离技术能够剔除清开灵注射液中的胆酸,为研究小分子物质在中药注射液中的作用提供了新的研究方法。