耐顺铂人肺腺癌细胞系A549^DDP耐药机理进一步探讨

应用递增浓度的方法建立了一株顺铂（ＣＤＤＰ）耐药细胞系Ａ５４９ＤＤＰ。用溴化乙啶荧光分光光度法测定细胞内Ｐｔ－ＤＮＡ链间交联物（ＩＣＬ）；用无焰原子吸收光谱法测定细胞浆内及细胞核内铂含量；用流式细胞法及荧光显微镜测定铂的外排速度。结果显示：耐药细胞Ａ５４９ＤＤＰ较亲代敏感细胞Ａ５４９对ＣＤＤＰ耐受性增加８．９倍，与亲代敏感细胞Ａ５４９相比，Ａ５４９ＤＤＰ胞浆内及核内ＣＤＤＰ积聚分别为亲代细胞的１６．９％与２４．３％，铂含量与ＣＤＤＰ浓度正相关；Ａ５４９ＤＤＰ外排ＣＤＤＰ的功能较Ａ５４９明显增强，ＩＣＬ形成量低８４．１％，而修复功能增强２倍。结果提示：Ａ５４９ＤＤＰ细胞内ＣＤＤＰ积聚减少和修复功能增强是ＣＤＤＰ的主要耐药机理。     

克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549^DDP耐药相关基因的差异表达片段

目的：克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示法技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549^DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序,同源性分析,其中2个片段（A1、D1）在GeneBank中未发现同源序列,一个片段（A2）与白介素－1β转化酶（Interleukin 1 β怀脲,ICE）89％同源性,一个片段（D2）与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100％同源。A1、A2cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2cDNA片段仅表达于A549^DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549^DDP间的基因差异3表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

去甲斑蝥酸钠对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用

[目的]探讨去甲斑蝥酸钠(SNCTD)对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其对耐药细胞周期的影响。[方法]⑴采用CCK法筛选出SNCTD对A549/DDP的无毒浓度(即对细胞抑制率<10%的药物浓度),并检测出顺铂及与无毒浓度SNCTD联合对耐药细胞株的IC50。⑵光学显微镜下观察无毒浓度SNCTD组、单纯DDP处理组及联合用药组用药48h细胞形态的变化。⑶采用流式细胞仪观察用药48h后正常细胞组、无毒浓度SNCTD组、DDP组及DDP+SNCTD组对A549/DDP细胞周期的影响。[结果]⑴SNCTD对A549/DDP的无毒浓度为5μg/ml,与DDP联合用药降低A549/DDP的耐药逆转倍数为1.97。⑵无毒浓度SNCTD处理耐药细胞组光学显微镜下细胞形态未见明显改变,而联合用药组比单纯DDP作用后细胞形态明显变差。⑶无毒浓度SNCTD处理耐药细胞后细胞周期未见明显改变,单纯DDP处理后细胞阻滞在S期,联合用药后S期减少,G0/G1期细胞增多。[结论]SNCTD对A549/DDP具有耐药逆转作用,与DDP联用对耐药细胞有协同杀伤作用。     

Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞的协同抗肿瘤作用

背景与目的 Amorphigenin是从紫穗槐属植物的种子中分离提取的鱼藤酮类化合物,研究发现amorphigenin对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用。本研究拟探讨amorphigenin对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的抗肿瘤作用及其可能的分子机制。方法采用CCK-8法测定A549/DDP细胞的增殖;克隆形成实验测定A549/DDP细胞的克隆形成;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot技术检测caspase-3、PARP和LRP蛋白的表达。结果Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞的增殖48 h[半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentra-tion, IC50）]为（2.19±0.92）μmol/L、抑制克隆形成及诱导细胞凋亡。此外,Amorphigenin与顺铂联合可协同地抑制A549/DDP细胞生长和促进凋亡;降低耐药蛋白LRP蛋白的表达。结论 Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞增殖和促进细胞凋亡;amorphigenin可能是通过抑制耐药蛋白LRP蛋白表达,进而与顺铂对A549/DDP细胞产生协同抑制作用。     

靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的:探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-completion gene 1,ERCC1)逆转耐顺铂(cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法:(1)常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的ERCC1-siRNA转染细胞,转染浓度分别为100、200、300 nmol/L,并设空白转染、Lip转染对照组,观察转染效果。(2)采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测肿瘤细胞转染siRNA后ERCC1基因和蛋白的表达。(3)MTT法检测肿瘤细胞耐药指数,观察ERCC1靶向siRNA逆转A549/CDDP细胞顺铂耐药的效果。结果:(1)Lip组、siRNA-neg组转染效率分别为(56.38±9.82)%、(63.54±4.87)%,SiRNA-ERCC1①组、siRNA-ERCC1②组、siRNA-ERCC1③组转染效率分别为(43.62±6.08)%、(65.85±9.61)%和(78.93±4.86)%。(2)针对ERCC1的siRNA转染A549/CDDP后,细胞ERCC1 mRNA及蛋白表达均下调,siRNA-ERCC1(300 nmol/L)组效应最强,分别下降至(11.19±6.82)%和(20.88±6.57)%(P<0.01)。(3)A549/CDDP细胞转染后耐药倍数减为6.05、4.64、2.94,空载体对照组细胞的耐药倍数为9.6。结论:RNA干扰技术封闭ERCC1基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性,且呈一定的浓度依赖性;ERCC1基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点。     

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９／ＤＤＰ耐药细胞的多药抗药机理。方法;应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位ＤＮＡ断裂点的末端标记法观察细胞亡的状况,用免疫组化法检测ｂｃｌ－２基因的表达。结果：癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改革。３μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ,７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９细胞ＤＮＡ裂解片断呈现典型的阶梯状排列条喧,而在５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９／     

地塞米松预处理人肺腺癌 A549 细胞对顺铂抗肿瘤活性的影响

目的：探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）预处理人肺腺癌A549细胞后,对化疗药物顺铂（cispla—tin,DDP）抗肿瘤活性的影响。方法：以不同浓度（500、1000nmol／L）DEX预先作用于人肺腺癌A549细胞12h后,再用不同浓度（1．25、2．5、5u/ml）DDP处理。流式细胞术测定细胞凋亡,细胞计数观察细胞生长密度、形态。结果：DEX对A549细胞增殖有抑制作用。DDP能够明显抑制A549细胞增殖,促进其凋亡。DEX预处理后DDP干预A549细胞的增殖抑制作用较单一用DDP增强,且随着DEX浓度的增加,其对化疗药物DDP凋亡抑制作用的影响增强。结论：DEX预处理对顺铂诱导的人肺腺癌A549细胞的凋亡具有明显的促进作用,能增强DDP的抗肿瘤活性。     

人肺腺癌细胞耐顺铂株A549/CDDP的比较蛋白质组学研究

背景与目的 化疗是肺癌综合治疗的重要部分,但是肿瘤细胞耐药常导致化疗失败.本研究采用蛋白组学方法研究人肺腺癌细胞A549对顺铂产生耐药性前后的蛋白表达差异,筛选有价值的靶位.方法 以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的方法,诱导建立耐顺铂细胞株A549/CDDP.对A549与A549/CDDP进行蛋白组学研究,即利用双向凝胶电泳(2-DE)分离两组总蛋白后,通过图像分析寻找表达差异的蛋白,对其进行MALDI-TOF质谱分析.结果 比较两者2-DE图谱,得到差异蛋白点82个;对其中6个差异蛋白点进行肽质量指纹图分析,鉴定出葡萄糖调节蛋白75、核糖体蛋白S4、线粒体F1-ATP合酶β亚单位、免疫球蛋白重链可变区;以上差异蛋白均在耐药株中过表达,而在对照组细胞中表达下调或不表达.结论 所鉴定的差异蛋白将为阐明肺癌细胞对顺铂耐药性产生的机制提供线索,也为筛选具体潜在价值的肺癌化疗靶位提供理论依据.     

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等;DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带;ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05);而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。     

靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的: 探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1（excision repair crosscompletion gene 1，ERCC1）逆转耐顺铂 (cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法：(1) 常规体外培养A549/CDDP细胞，以脂质体包裹的ERCC1siRNA转染细胞，转染浓度分别为100、200     

SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响

背景与目的 肺癌是最严重的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌发病率在肺癌中居首位.部分患者对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因.SOX4是转录调节因子,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控β-catenin的表达对Wnt信号通路进行调控.本研究旨在探讨SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响.方法 体外诱导法建立顺铂耐药的肺癌细胞株A549/DDP,CCK8法检测A549及A549/DDP细胞对顺铂的耐药性.绘制A549与A549/DDP细胞生长曲线.Western blot检测耐药细胞株中SOX4的蛋白表达水平.CCK8法检测敲减SOX4后耐药细胞株A549/DDP对顺铂耐药性.实时定量PCR和免疫印迹法检测敲减SOX4后A549/DPP细胞中β-catenin和Survivin蛋白的表达.结果 成功构建非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP,其耐药性是亲本细胞的13.7倍,差异有统计学意义(P<0.001).生长曲线显示耐药细胞株与亲本细胞增殖速度没有统计学差异(P<0.05);与A549细胞相比,耐药细胞A549/DDP细胞中SOX4的表达显著增高(P<0.001).敲减SOX4后,A549/DDP细胞的耐药性显著降低;敲减SOX4后,A549/DDP细胞中β-catenin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平显著降低.结论 SOX4的表达水平影响非小细胞肺癌细胞A549对顺铂的耐药性.     

耐顺铂人肺腺癌细胞系A549DDP的建立及耐药机制

采用递增顺铂（ＤＤＰ）浓度的方法，体外连续培养建成一株耐ＤＤＰ的人肺腺癌细胞系Ａ（５４９）ＤＤＰ，耐ＤＤＰ为亲代Ａ（５４９）的２４．４倍。在无ＤＤＰ的培养基中培养５月余，其耐药性仍稳定。Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞内谷胱甘肽（ＧＳＨ）水平显著高于亲代细胞（Ｐ＜０．０１）。ＢＳＯ耗竭细胞内ＧＳＨ后，Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ敏感性增加５倍，ＢＳＯ对亲代Ａ（５４９）细胞无增敏作用，Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞ＧＳＴ酶同功酶ＧＳＴ—π含量较Ａ（５４９）高１．６倍，却无ＧＳＴ基因扩增，表明ＧＳＨ／ＧＳＴ解毒系统参与Ａ（５４９）ＤＤＰ耐药性的产生。实验结果亦示Ａ（５４９）ＤＤＰ与卡铂及氨甲喋呤间存在交叉耐药，而与易产生ＭＤＲ或ａｔＭＤＲ之ＡＤＭ、ＶＣＲ、ＶＰ－１６、ＶＭ－２６无交叉耐药，Ａ（５４９）细胞无Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）表达，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ研究Ａ（５４９）ＤＤＰ无ｍｄｒｌＴｏｐｏⅡ基因扩增，提示Ａ（４５９）ＤＤＰ细胞系与ＭＤＲ及ａｔ－ＭＤＲ无交叉耐药。     

人肺腺癌A549及A549/DDP细胞株差异蛋白质组学分析

 目的 比较人肺腺癌细胞株A549和耐顺铂株A549/DDP细胞的蛋白表达谱,筛选肺癌耐药相关蛋白,为 阐明肿瘤细胞的耐药提供新线索。 方法 对两种细胞株进行比较蛋白质组学研究,利用双向凝胶电泳技术（2-DE）分离细胞总蛋白,经 图像分析软件分析、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白质点 ,并用免疫细胞化学（ICC）对部分差异蛋白进行验证。 结果 获得分辨率高、重复性好 的A549、A549/DDP总蛋白图谱,初步筛选出差异蛋白质点,经质谱分析及数据库检索,鉴定出 13种差异表达蛋白质,这些蛋白与细胞代谢、结构、解毒和DAN修复、以及信号转导等相关。 结论 A549、A549/DDP细胞株存在差异表达蛋白质点,提示这些蛋白可能与A549细胞耐顺铂相关,为 研究肺癌耐药提供依据。     

多西他赛诱导肺腺癌A549/DTX细胞株的建立及耐药机制分析

目的 建立人肺腺癌细胞A549多西他赛（DTX）耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法 采用逐步增加多西他赛浓度、间歇诱导的方法,建立人肺癌A549/DTX体外耐药细胞模型;MTT法检测A549/DTX的耐药特性;流式细胞仪比较多西他赛对耐药细胞株A549/DTX及亲本细胞株A549凋亡的影响;Western blot分析多西他赛作用后两种细胞凋亡调节因子Bc1-2、Bax表达差异。结果 MTT显示A549/DTX的多西他赛耐药指数为18.5;流式细胞分析显示经12.5、25、50 μg/L多西他赛作用24 h后,A549/DTX的细胞凋亡率为(6.2±4.1)％、(13.6±2.7)％、(20.5±5.1)％,A549细胞凋亡率为(15.7±3.5)％、(28.5±2.9)％和(33.1±4.8)％,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）;Western blot显示,与A549相比,A549/DTX细胞Bcl-2蛋白表达明显升高,Bax蛋白明显降低(P＜0.01)。结论 逐步增加浓度、间歇诱导的方法建立了稳定、耐药性较高的A549/DTX细胞株,并认为凋亡受抑是A549/DTX的耐药机制之一,与Bcl-2表达上调、Bax表达下调相关。     

热疗联合а-IFN逆转人肺腺癌细胞A549/CDDP耐药性的研究

目的探讨热疗联合α-IFN对人肺腺癌细胞A549/CDDP耐药逆转作用及可能机制。方法采用体外细胞培养技术,培养人肺腺癌细胞系A549及其耐药株A549/CDDP。设计1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml浓度的CDDP,分别联合100U/ml、500U/ml、1000U/ml浓度а-IFN,在42℃热疗干预2h后,采用MTT法检测2种细胞对化疗药物CDDP的敏感性,采用流式细胞仪间接免疫荧光法,检测α-IFN、CDDP、热疗处理前后细胞中P-糖蛋白（P-gp）的表达及细胞内荧光药物CDDP的聚集量。结果热疗、а-IFN分别联用CDDP时,对A549/CDDP细胞的抑制率较单用CDDP时的抑制率高,差异有统计学意义（P〈0.05）。热疗联合а-IFN与CDDP时,对A549/CDDP细胞的抑制率较热疗、а-IFN分别联用CDDP时明显升高（P〈0.05）。热疗、а-IFN分别联合CDDP时,A549/CDDP细胞P-gp表达率较单用CDDP时下降,细胞内荧光强度增强,热疗联合α-IFN与CDDP,CDDP/A549P-gp表达率明显下降,细胞内荧光强度显著增强。结论а-IFN、热疗能部分逆转人肺腺癌细胞系A549/CDDP的耐药性;а-IFN联合热疗可提高逆转肺癌细胞耐药效应,其机制可能与抑制P-gp表达,增加细胞内化疗药物的积聚有关。     

人肺腺癌多药耐药细胞系A549/cDDP的建立及相关基因表达检测

背景与目的 现有研究表明,肺癌细胞多药耐药造成的化疗失败是影响患者生存率的主要原因.本研究旨在建立人肺癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性和机制.方法 应用人肺腺痛细胞株A549,采用顺铂(cDDP)大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系A549/cDDP.相差显微镜观察细胞形态和结构差异,绘制两种细胞的体外生长曲线.用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平.结果 A549/cDDP对多种抗癌药物耐药,各种抗癌药物IC50显著提高:(70.±4.9)%的A549/DDP细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(42.4±5.6)%;(29.4±2.9)%的A549/DDP细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(21.4±3.5)%,二者有差异(t=11.94;t=5.56,P均<0.01);A549/cDDP和A549细胞的GSH/GST表达无明显变化(P>0.05).RT-PCR检测发现A549/cDDP中的MDR mRNA及MRP mRNA高表达.结论 建立的A549/cDDP具有明确的多药耐药性,其多药耐药基因MDR mRNA及MRP mRNA表达升高.