华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的　构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法　根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果　成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论　筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。     

华支睾吸虫Rho GTPase样基因的识别、克隆表达与免疫鉴定

目的 对新发现的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）的Rho GTPase样基因进行克隆、表达和免疫学鉴定。方法 将用生物信息学方法识别的华支睾吸虫cDNA质粒文库中的Rho GTPase样基因的完整编码序列（CDS）克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中，在大肠埃希菌BL21中用IPTG诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Western blotting）进行分析，并用镍离子金属螯合亲和层析柱进行纯化。结果 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因的完整阅读框含576个碱基，编码192个氨基酸，理论分子量为21．7kDa。PCR、双酶切及DNA测序的结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-Rho GTPase构建成功。SDS-PAGE结果表明Rho GTPase基因在大肠埃希菌BL21中获得了高效表达，重组蛋白可被感染华支睾吸虫的猫血清识别，表明其具有免疫反应性。亲和层析获得了高纯度的蛋白。结论 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因可在原核系统中获得有免疫学活性的高效表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫CsTC基因产物的体外制备及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫CsTC基因工程蛋白,并进行免疫学研究。方法用组氨酸标签亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白CsTC。将CsTC蛋白免疫BALB/c小鼠,制备其多抗血清。酶联免疫吸附(ELISA)检测抗血清抗体滴度,蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。结果纯化蛋白CsTC的浓度为(0.78±0.03)mg/ml,纯度达90%。间接ELISA结果显示,免疫过程中抗体滴度持续上升。Western-blot结果显示,免疫小鼠血清具有抗CsTC特异性。结论本研究制备的CsTC基因工程蛋白和抗CsTC抗血清可较好地用于后续CsTC的基因功能鉴定。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库，寻找、识别新基因，并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，表达出融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础。方法用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增，对产物为500bp以上的质粒进行测序，测序结果在NCBI和ExPasy，网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据pGEX-4T-1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体pGEx-4T-1上。构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定，并对鉴定过的重组体进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定。结果 发现CsGAPDH基因，完整阅读框含1017个碱基对，编码339个氨基酸，理论分子质量单位为37．02409ku，理论pI为6．66。序列分析显示，CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78％，具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE电泳显示表达产物在63ku处有1条特异性条带。结论 发现华支睾吸虫GAPDH基因，成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫蛋白酶体β12新基因的识别与克隆表达

目的识别华支睾吸虫蛋白酶体β2亚单位新基因（CsPSMB2），表达其重组蛋白，为进一步研究CsPSMB2的功能奠定基础。方法通过大规模eDNA文库随机测序，发现CsPSMB2新基因。并将其定向插入到pGEX-4T-1载体中。构建成功的载体在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定。结果发现了编码PSMB2基因的一个新成员CsPSMB2，CsPSMB2全长708个核苷酸，编码一个201个氨基酸残基的蛋白，理论分子量为22．5kD，预测的蛋白与人的PSMB2蛋白同源性为58％并且含有一个蛋白酶体结构域，成功登录GeneBank，登录号为AY849972。构建成功重组质粒pGEX-4T-1-CsPSMB2，经IPTG诱导后表达出PSMB2的GST融合蛋白。结论发现华支睾吸虫新基因CsPSMB2，成功构建了pGEX-4T-1-CsPSMB2重组表达载体并表达出了CsPSMB2的GST融合蛋白。为进一步研究CsPSMB2在华支睾吸虫中的功能和可能的应用研究奠定基础。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆和表达(英文)

华支睾吸虫病严重危害着人们的身体健康 ,研制快速诊断试剂盒对于华支睾吸虫病的防治显得非常重要。目前 ,市场上销售的快速诊断试剂盒 ,其诊断抗原主要来自华支睾吸虫成虫的粗抗原 ,抗原敏感性高 ,特异性却不高 ,所以寻找并生产基因工程重组抗原有着非常重要的意义。半胱氨酸蛋白酶是一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶 ,多种寄生虫都能产生或分泌半胱氨酸蛋白酶 ,它对寄生虫的生存、发育以及在寄生虫与宿主的相互关系上均有着极其重要的作用。越来越多的科研工作者开始重视它的免疫诊断价值 ,本文研究的目的是为华支睾吸虫快速诊断试剂盒寻找基因工程重组抗原。我们根据已知华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因序列设计一对引物 ,用文库构建试剂盒提取总RNA ,并反转录成cDNA ,以cDNA为模板 ,通过PCR技术从cDNA中扩增出目的基因。PCR产物通过测序鉴定 ,用工具酶BamHI和XholI同时消化目的基因和pGEX - 4T - 1原核表达载体 ,消化后的产物用连接酶连接 ,构建成 pGEX - 4T - 1-CP重组体 ,并将其转入Jm10 9大肠杆菌中。用PCR初步筛选阳性克隆 ,共获得阳性克隆 8个 ,再用双酶切和测序进一步鉴定初步筛选的阳性克隆。挑取阳性克隆 ,37℃条件下用IPTG诱导重组体表达 ,表达产物通过SDS -PAGE电泳鉴定。通过上述实验 ,获     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的表达和鉴定

目的将目的基因CsSCCRO转染Hela细胞,检测转染效率和表达水平,为进一步在细胞学水平研究编码蛋白的功能提供依据。方法将目的基因CsSCCRO克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,通过脂质体方法转入Hela细胞,RT-PCR和荧光观察来鉴定转录和表达水平。结果真核重组质粒pEGFP-N1-CsSCCRO转入Hela细胞后稳定表达荧光蛋白;RT-PCR鉴定转染的Hela细胞,扩增产物约为780bp,与预期值相符。结论CsSCCRO基因能够转染到Hela细胞中,并且能与GFP高效转录和翻译成融合蛋白。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的　通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。　结果　发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。　结论　发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

目的　构建编码华支睾吸虫3磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体,并分析其在大肠埃希菌中的表达。　方法　用Trizol法从华支睾吸虫 3成虫体内提取总RNA,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接,重组体转入JM109大肠埃希菌,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选1个阳性菌落,用异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。　结果　用逆转录聚合酶链反应技术扩增出1条1248bp大小的片段,PCR产物测序鉴定正确;转化后得到10个克隆,双酶切、PCR扩增鉴定,其中6个为阳性克隆;表达产物用SDS PAGE鉴定,在相对分子质量70000处有1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。　结论　成功构建重组原核表达载体pGEX4T1PGK,所表达的蛋白为含有谷胱甘肽的融合蛋白     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶（mGST）新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA（质粒）文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a（＋）,在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a（＋）-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。     

华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究

目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因（克隆号Cs004f03）,将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框（ORF）有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。     

华支睾吸虫分泌蛋白基因（CsCrSP）的克隆和生物信息学分析

目的 筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因，克隆并构建重组表达载体。 方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选，通过BLASTn程序进行序列比对，识别华支睾吸虫新基因，并应用Motifscan，NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域及进化树分析。 结果 筛选出华支睾吸虫未知基因Pcs004f03序列，含689 bp；应用Vecter NTI分析，理论相对分子质量（Mr）为21 000，完整的ORF含561 bp，编码187aa。该基因有潜在的糖激化位点、3个N肉豆蔻酰化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶Ｃ磷酸化位点、cAMP-and cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点。利用软件在线搜索发现在第1～50aa内有一明显的信号肽，初步推断CsCrSP为一种分泌蛋白。结论 CsCrSP基因为华支睾吸虫富含半胱氨酸分泌蛋白基因。     

华支睾吸虫CsSP16.4基因的克隆、序列分析和功能预测

目的通过筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因;克隆并构建重组表达载体,为进一步研究其功能及其应用价值奠定基础。方法对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选,通过Blastn程序进行序列比对,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motifscan,NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析及进化树分析。结果筛选得到的序列长725bp,应用VecterNTI分析,理论分子量为16.4kDa,理论等电点(pI)为6.44,疏水氨基酸(AILFWV)占36%,带电荷氨基酸(RKHY-CDE)占29%,极性氨基酸(NCQSTY)占28.8%,酸性氨基酸(DE)占8.65%和碱性氨基酸(KR)占9.21%。应用NCBI站点的ORFFinding分析发现其含4个可能的ORF,其中最长的ORF,从第42到第494bp,起始密码为ATG、终止密码为TAG,完整阅读框含450bp,编码150aa。发现该基因有潜在的2个糖激化位点、3个N肉豆蔻酰化位点和1个蛋白激酶C磷酸化位点。结论确定该基因为华支睾吸虫分泌蛋白基因,为作为诊断候选抗原提供了依据。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较

目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果。方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因, 与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a?CP和真核表达质粒pPIC9K?CP, 双酶切及测序鉴定后, 将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌（E. coli） BL21 （DE3） 和毕赤酵母GS115中诱导表达、 纯化; 将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清, 比较诊断效果。结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在, 表达量为6.84 mg/L; 真核表达系统表达量达到65.00 mg/L, 且为可溶性蛋白; 两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00%（57/60） 和 93.30% （56/60）, 特异性分别为91.67% （77/84） 和94.10% （79/84）, 差异均无统计学意义 （P均 > 0.05）。结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值。