Effects of heat shock protein-antigen peptide complexes (HACs) in melanoma B16 cell line on transplanted tumor development in mice

目的 :建立黑色素瘤 B16细胞热休克蛋白 -抗原肽复合物 (HACs)的制备方法并测其抑瘤效应。方法 :应用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤制备 HAC粗提物 ,应用 SDS- PAGE纯化 HACs,并测其抑瘤效应。结果 :应用 SDS- PAGE纯化的 HAC6 0、 HAC75和 HAC97不同程度地降低肿瘤发生率 ,延迟肿瘤发生时间和减慢肿瘤生长速度。结论 :6 0 0 0 0～ 970 0 0 HACs具有抑制瘤作用     

Immunogenecity and tumor-inhibiting effects of HSP-antigen peptide complex in melanoma B16 cells in mice

目的:黑色素瘤B16细胞热休克蛋白-抗原肽复合物(HACs)及其粗提物(HAC-CEs)的制备,以及它们的免疫原性和抑瘤效应的研究.方法:应用Sephacryl S-200凝胶过滤制备HAC-CEs,应用亲和层析纯化HACs,并测其免疫功能和抑瘤效应.结果:应用凝胶过滤制备的HAC-CE3、HAC-CE4、HAC-CE5和应用亲和层析纯化的HAC60,HAC75和HAC97均不同程度地降低肿瘤发生率、延迟肿瘤发生时间和减少移植黑色素瘤C57BL/6J小鼠死亡率;同时,伴有小鼠脾细胞IFN-γ和IL-2分泌活性及CTL杀伤率的增加.结论:分子量为60000～97000的HACs具有免疫原性和抑瘤效应,本研究为制备肿瘤疫苗提供重要的实验依据.     

Effector cells derived from naive T cells used in tumor immunotherapy of mice bearing B16 melanoma

Background Adoptive cell transfer （ACT） immunotherapy has been used clinically for years to treat malignancies.Improving the killing efficiency of effector cells,such as tumor-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs）,is an important component for enhancing the clinical response of cancer immunotherapy.Hence,we explored a novel method for preparing cancer-specific CTLs using naive T lymphocytes.Methods C57BL/6 mice bearing B16 melanoma tumors were pretreated with cyclophosphamide （CTX） by peritoneal injection.The immunosuppressive influence of CTX on tumor regression and the tumor microenvironment was assessed.Naive T cells and T cell pools were isolated via negative selection using immunomagnetic beads.The proliferative potential and cytokine production of different T cell subpopulations were evaluated in vitro.Tumor-specific CTLs derived from naive T cells （naive CD4＋ T cells：naive CD8＋ T cells=2：1） and pooled T cells were generated in vitro,respectively.B16 melanoma-bearing C57BL/6 mice were pretreated with CTX,followed by ACT immunotherapy using dendritic cell-induced CTLs.The homing abilities of the effector cells and interleukin-2 （IL-2）,interferon-y,granzyme B,and perforin mRNA levels in tumor tissues were evaluated,and the change in tumor volume was measured.Results Mice receiving CTX peritoneal pretreatment injections did not display tumor regression compared with control mice.However,a significant downregulation of splenic Tregs and tumor growth factor-β1 （TGF-β1） and interleukin-10 （IL-10） serum levels was observed （P ＜0.05）.Naive T cells showed a stronger proliferative capacity and elevated cytokine production than did pooled T cells （P ＜0.05）.In addition,effector cells generated from naive T cells displayed more potent antitumor activity in vivo than those derived from pooled T cells （P ＜0.05）.Conclusion Effector cells derived from the naive T cells possess a stronger proliferative potential,homing capacity,and enhanced cytokine production,which leads to a superior antitumor response.     

联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞的影响

目的探讨联合应用自然杀伤(NK)细胞及细胞毒T细胞(CTL)对黑色素瘤B16细胞的作用。方法提取NK细胞及CTL,分别用白细胞介素-2(IL-2)(6 000、600IU/L)及植物血凝素(8μg/mL)活化,流式细胞仪检测细胞表面受体,将NK细胞及CTL互为靶细胞及效应细胞进行细胞毒性实验;以黑色素瘤B16细胞为靶细胞检测CTL的杀伤率。结果 NK细胞表面受体NK1.1+的百分比在87%以上,NKp46+在90%以上;CTL表面受体CD3+的百分比在99%以上,CD8+在98%以上。NK细胞与CTL相互无细胞毒性,联合应用NK细胞与CTL明显增加对黑色素瘤B16细胞的杀伤作用。结论联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞有协同杀伤作用。     

β防御素2在恶性黑色素瘤B16细胞中的稳定表达及其生物学效应研究

目的 建立稳定表达防御素mBD2的恶性黑色素瘤细胞B16-mBD2,研究mBD2对B16细胞生物学特性的影响.方法 在前期构建好mBD2真核表达质粒的基础上,脂质体法转染恶性黑色素瘤B16细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株B16-mBD2,RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表...     

茶多糖对实验小鼠B16F10细胞瘤治疗效应的机制研究

目的:观察茶多糖(TPS)对实验小鼠黑色素B16F10细胞瘤治疗效应,探讨茶多糖抑制黑色素细胞瘤的免疫学机制。方法:将C57BL/6随机分组,建立小鼠黑色素细胞瘤模型,通过持续灌胃服用茶多糖28 d,观察并记录荷瘤小鼠一般情况、肿瘤体积变化,最终检测实验小鼠NK细胞活性以及IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:1TPS治疗组延缓了小鼠体质量改变,差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组尤为明显(P<0.01);2TPS治疗组小鼠肿瘤直径与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组差异最为显著(P<0.01),中剂量抑瘤率最好;3TPS治疗组的NK细胞活性在效靶比为20∶1时,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),中剂量治疗组的NK活性达39.06%,差异有显著统计学意义(P<0.01);4TPS治疗组IFN-γ分泌水平均显示升高,而IL-4分泌水平则呈现下降,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组变化尤为显著(P<0.01)。结论:在本实验条件下,TPS对荷瘤小鼠显示出较为有效的治疗效应,以中剂量治疗组(400 mg/kg)效果最好,其机制可能与增强小鼠NK细胞活性、增加IFN-γ以及降低IL-4分泌水平等免疫调节有关。     

特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对黑色素瘤抑瘤作用的比较

目的：比较特异性抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导的杀伤细胞（CIK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法：采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK和CTL细胞共同培养,分析其免疫表型,流式细胞检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数（AI）、细胞增殖指数（PI）的变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的抑瘤作用。结果：DC-CIK及DC-CTL均可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并具有诱导细胞凋亡的作用,但DC-CIK与DC-CTL之间无显著性差异;DC-CTL细胞组抑瘤作用较DC-CIK明显升高。结论：特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对B16黑色素瘤均有抑瘤作用,但DC-CTL更高效而特异。     

Oncol2012: 初始T细胞来源的效应细胞在荷B16黑色素瘤小鼠免疫治疗中的应用

背景：恶性肿瘤的过继性细胞移植免疫治疗已投入临床使用多年。如何提高效应细胞的杀伤能力,如肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),已经成为临床肿瘤免疫治疗的一个重要的努力方向。因此,我们探索了一种新的方法通过使用一定比例混合的CD4 、CD8 亚种群的初始T淋巴细胞来制备更有效的特异CTL并评价其肿瘤杀伤效率。 方法：实验使用荷B16恶性黑色素瘤的C57BL/6老鼠,并给予CTX腹腔注射进行预处理。分别评估CTX腹腔注射对肿瘤生长的影响情况及对肿瘤微环境的调节情况。应用磁珠分别阴性分选初始T细胞和总T细胞。在体外环境中检测并对比不同种T细胞的增殖能力以及细胞因子分泌水平。分别由初始T细胞（初始CD4 T：初始CD8 T=2:1）和总T细胞诱导分化得到肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。经CTX预处理的实验小鼠给予肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞回输治疗,回输后检测效应细胞的归巢能力,检测肿瘤组织中IL-2、IFN-r、颗粒酶 B, 及穿孔素mRNA 水平,并测量肿瘤大小绘制生存曲线。 结果：CTX预处理组较对照组肿瘤生长情况无差异,但CTX预处理后较对照组可明显降低实验鼠脾脏中Treg细胞水平,以及血清中TGF-β1和IL-10 的水平（P＜0.05）。在体外初始T细胞较总T细胞表现出更强的增殖能力及细胞因子分泌能力（P＜0.05）。由初始T细胞诱导产生的效应细胞与由总T细胞诱导产生的效应细胞在归巢能力方面有显著差异（P＜0.05）,肿瘤组织中IL-2、IFN-r、颗粒酶 B 及穿孔素mRNA 水平存在显著差异（P＜0.05）。 结论：依据上述结果,我们认为由初始T细胞诱导产生的效应细胞拥有更强的增值能力、更强的归巢能力及细胞因子分泌水平,所以由初始T细胞诱导产生的效应细胞可以介导产生更强的抗肿瘤效应。     

蝎毒对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用

目的：观察蝎毒（scorpion venom, SV）及其分离组分对小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法：采用MTT法检测肿瘤细胞存活率,集落形成法检测肿瘤细胞增殖, 采用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果：400和800 mg•L^-1的SV可明显抑制B16黑色素瘤细胞生长 (P<0.01或P<0.05)。蝎毒组分（SV-Ⅰ、SV-Ⅱ 和SV-Ⅲ）在浓度为200、400 及800 mg•L^-1时,对B16细胞生长有明显的抑制作用 (P<0.05~P<0.01);在400和800 mg•L^-1 时,可使G₀/G₁期细胞数明显减少 (P<0.05~P<0.01),G₂+M期细胞明显增多(P<0.05~P<0.01),S期细胞呈降低趋势,而SV对细胞周期进程未见明显影响。当SV、SV-Ⅰ、SV-Ⅱ及SV-Ⅲ的浓度为400和800 mg•L^-1时, 对B16细胞集落形成均有明显的抑制作用 (P<0.01)。结论：在一定浓度范围内蝎毒及其组分对B16黑色素瘤细胞的存活与增殖均有明显的抑制作用,纯化后各组分的抑瘤作用优于蝎毒,但其抑制作用低于阳性对照丝裂霉素 (Mitomycin-c, MMC) 组。提示蝎毒引起细胞周期进程改变可能是其抑瘤作用的机制之一。     

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

microRNAs在恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中差异表达的研究

目的: 探讨及分析黑色素瘤细胞B16F0和B16F10中microRNAs（miRNAs）表达差异性,筛选与恶性黑色素瘤增殖、迁移和侵袭相关的miRNAs。方法: 通过体内和体外实验分别验证B16F0和B16F10细胞的差异,并通过RiboArrayTMmiDETECTTMMouse Array分析小鼠黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中miRNAs表达的差异性,筛选出与恶性黑色素瘤相关的miRNAs,并应用Real-time PCR验证筛选结果的可信性。结果: B16F10细胞比B16F0具有更强的迁移和增殖能力,芯片结果显示,与黑色素瘤B16F0细胞相比,在B16F10细胞中有38个miRNAs存在表达差异,其中15个miRNAs表达上调,23个miRNAs表达下调,均具有统计学意义。Real time PCR对部分miRNAs进行验证,发现与芯片分析结果一致,其中miR-26a-1-3p、miR-28b、miR-29b-3p、miR-24-2-5p表达显著上调,而miR-763、miR-431-5p、miR-205-5p、let-7c-2-3p表达显著下调。结论: 差异表达的miRNAs与恶性黑色素瘤的发生、发展可能存在密切相关性,可能为恶性黑色素瘤的早期诊断及治疗提供有力的靶向依据。     

三氧化二砷对黑素瘤B16细胞黏附和迁移的影响

目的:了解三氧化二砷(As₂O₃)对黑素瘤B16细胞迁移能力的影响,评价As₂O₃抗肿瘤侵袭和转移能力。方法:用Transwell侵袭转移模型评价As₂O₃抗黑素瘤B16细胞的侵袭和转移作用。MTT法检测B16细胞的黏附能力。流式细胞术检测B16细胞表面黏附分子CD44的表达情况。结果:As₂O₃可显著抑制B16细胞的迁移和黏附能力(P<0.05~P<0.01),降低细胞表面黏附分子CD44的表达(P<0.01)。结论:As₂O₃具有抗黑素瘤B16细胞侵袭和转移作用,降低细胞表面黏附分子CD44的表达可能是其机制之一。     

和厚朴酚对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖以及黑色素合成的影响

目的探讨和厚朴酚对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖以及细胞内黑色素合成的影响。方法体外培养小鼠B16细胞,MTT法检测和厚朴酚对B16细胞增殖的影响;DAPI染色法观察和厚朴酚对B16细胞细胞形态的影响;NaOH裂解法检测和厚朴酚对黑色素含量的影响。结果和厚朴酚浓度为51、0、204、0、80μmol/L作用B16细胞,在不同的用药时间122、4和48 h,和厚朴酚对B16细胞增殖的IC50分别为23.41、3.1和11.4μmol/L;同时和厚朴酚作用B16细胞12 h后,经DAPI染色,B16细胞呈现典型的凋亡形态;另外采用204、0、80μmol/L的和厚朴酚分别作用B16细胞,B16细胞内黑色素合成量也呈现降低的趋势。结论和厚朴酚能有效地抑制B16细胞增殖,且其抑制作用具有时间和浓度依赖性;药物作用后的B16细胞呈现凋亡形态并出现凋亡小体;和厚朴酚对B16细胞内黑色素合成也呈现抑制作用但不明显。     

壬二酸对人黑素细胞和鼠黑素瘤B16细胞黑素合成功能的影响

目的 建立体外培养的正常人表皮黑素细胞系，检测壬二酸对人表皮黑素细胞和鼠黑素瘤B16细胞黑素合成的影响。方法 体外人表皮黑素细胞和鼠黑素瘤B．。细胞培养，TRP-1染色观察壬二酸作用后，细胞形态的变化；测定壬二酸对人表皮黑素细胞和鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活性及黑素含量变化观察壬二酸的脱色素作用。结果 壬二酸作用于人表皮黑素细胞后，可见细胞树突明显减少；壬二酸作用于B16细胞后，细胞形态无明显改变。壬二酸抑制人表皮黑素细胞和鼠黑素瘤B16细胞的酪氨酸酶活性，细胞黑素合成减少，而且具有浓度依赖性。结论 壬二酸对体外培养的人表皮黑素细胞和鼠黑素瘤B16细胞的酪氨酸酶活性及黑素生成都有抑制作用，可临床应用于治疗色素性疾病。     

SP和CGRP阳性神经元在大鼠上橄榄复合体中的分布

目的：研究大鼠上橄榄复合体（SOC）中P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应阳性神经元的分布特点,并探讨其意义．方法：采用免疫组织化学及免疫荧光双标记技术,对大鼠脑干进行冰冻切片,在显微镜下观察sP和CGRP免疫阳性神经元胞体及神经纤维的分布特点．结果：SP阳性神经元胞体主要分布在斜方体核（Tz）,CGRP阳性神经元胞体主要分布在外侧上橄榄核（ISO）及Tz,在Tz中尚可见大量CGRP阳性神经终末包绕sP和CGRP双标记神经元胞体．结论：CGRP与SP在听觉传导功能中有协同作用,且Tz内sP阳性神经元可能参与了对LSO内CGRP阳性神经元的调控,进而参与调节橄榄耳蜗束的神经活动．     

咪喹莫特抑制小鼠体表黑色素瘤生长和促使肿瘤特异性放疗增敏的实验研究

目的研究咪喹莫特联合外放疗对C57BL/6小鼠黑色素瘤模型肿瘤生长的影响,并判定咪喹莫特对肿瘤特异性放疗增敏的疗效。方法建立C57BL/6小鼠(n=20)的体表黑色素瘤模型,随机分为对照组、放疗组、咪喹莫特治疗组和放疗联合咪喹莫特治疗组。测量肿瘤生长体积,观察肿瘤生长延迟效应,并采用免疫组织化学检测和生存曲线评估咪喹莫特对肿瘤放疗增敏效果。结果放疗联合咪喹莫特治疗组肿瘤生长延迟最显著,其次治疗效果依次为咪喹莫特治疗组、放疗组和对照组。4组间两两比较,差异均有显著性意义(P<0.01)。C57BL/6小鼠黑色素瘤的组织病理学检测中,发现微管相关蛋白1轻链3B(MAP1LC3B)和α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)在放疗联合咪喹莫特治疗组呈高表达。3种不同治疗组的MAP1LC3B和α-SMA表达与对照组间比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。C57BL/6小鼠生存表证实,放疗联合咪喹莫特治疗组生存率明显优于其他治疗组和对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论咪喹莫特联合外放疗对C57BL/6小鼠黑色素瘤生长有绝对延迟效应,咪喹莫特可为新的肿瘤特异性放疗增敏诱导剂。     

融合蛋白G3G6和HST1致敏DC疫苗抗黑色素瘤的药效学研究

探究促性腺激素释放激素(GnRH)与胃泌素释放肽(GRP)偶联的融合蛋白(G3G6)和热休克蛋白65(HSP65)与六跨膜前列腺上皮抗原(STEAP1)偶联的融合蛋白(HST1)致敏树突状细胞(DC)的效果和致敏后DC对B16F10黑色素瘤的抑制杀伤作用。利用实验室现存工程菌表达融合蛋白G3G6和HST1,按未致敏DC(US-DC)组,G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)组,HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)组和G3G6及HST1联合致敏DC(GH-DC)组致敏小鼠骨髓来源的DC分化成熟,获得融合蛋白致敏的相应DC疫苗。将B16F10黑色素瘤细胞以1×10⁶个/只移植于C57BL/6J雄性小鼠构建黑色素瘤模型,DC疫苗免疫治疗,体内外实验探究DC疫苗的抗肿瘤药效。流式细胞术分析证明,融合蛋白有效刺激DC分化成熟;动物实验显示,与US-DC组相比,G3G6-DC黑色素瘤抑制率为35.75%,HST1-DC组为34.03%,GH-DC组为55.74%。研究结果初步证明,G3G6-DC和HST1-DC均可有效抑制黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的生长(P<0.05),且联合用药优于单独用药(P<0.01)。     

The Expression of Endothelin Receptor B in Melanoma Cells A375 and Sk-mel-1 and the Proliferative Effects of Endothelin 3 on A375 Cells

In order to investigate the expression of endothelin receptor B （ETR-B） in human malignant melanoma （MM） cells A375 and SK-mel-1 and the proliferative effects of endothelin 3 （ET3） on A375 cells, RT-PCR was applied to detect the expression of ETR-B gene in human MM cells A375 and SK-mel-1. MTT method was used to evaluate the growth enhancing effects of ET3 on A375 cell line in vitro. The results showed that ETR-B gene was expressed in both MM A375 and SK-mel-1 cells. ET3 had stronger ability to enhance the proliferation of A375 cells in vitro in a concentration-dependent manner. It was suggested that ET3/ETR-B might play an important proliferative role in MM.     

辅助性T细胞17及调节性T细胞在慢性乙型肝炎患者外周血的变化及意义

目的 探究辅助性T细胞17及调节性T细胞在慢性乙型肝炎病毒感染患者外周血的变化及意义。方法 以2016年5月—2017年5月在深圳市龙华区中心医院肝病房收治的120例慢性乙型肝炎病毒感染患者为研究对象,根据慢性乙型肝炎诊断标准分为轻、中、重度三组患者,其中轻度患者31例,中度患者48例,重度患者41例,同时选取本院60例健康体检者作为对照组。采用流式细胞仪对辅助性T细胞17（Th17）及调节性T细胞(Treg)进行监测,同时对各组患者的肝功指标:血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)进行检测,对四组患者的以上指标进行比较分析。结果 中度组ALT和AST的含量要高于轻度组,差异存在统计学意义（t=8.264、10.237,P<0.05）,重度组ALT和AST要高于中度组,差异存在统计学意义（t=11.036、17.209,P<0.05）。中、重度组乙型肝炎病毒感染者的Th17表达率均要高于健康对照组（t=16.230、18.714,P<0.05）;各感染组的Th17表达率差异存在统计学意义（F=22.783,P<0.05）;轻、中和重度组感染乙肝病毒的患者Treg表达率要高于健康对照组（t=3.201、3.784、4.115,P<0.05）,而不同程度地感染乙型肝炎的各组之间无差异（P>0.05）; 轻、中和重度组感染乙肝病毒的患者Th17/Treg 比值要高于健康对照（t=21.306、24.397、28.001,P<0.05）,且不同程度地感染乙型肝炎的各组之间差异存在统计学意义（F=35.067,P<0.05）。结论 慢性乙型肝炎病毒感染的患者随着病情的发展Th17和Treg细胞水平会呈现一定的上升趋势,Th17/Treg比值较单一的 Th17、Treg 表达率更能反映肝脏受侵害的病情发展。