CKS2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其抑制卵巢癌A2780细胞增殖

目的构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并探讨CKS2敲除对卵巢癌细胞A2780增殖的影响。方法根据siRNA原理设计两对靶向CKS2的shRNA序列(shRNA1、shRNA2)及阴性对照NC shRNA,并克隆到慢病毒表达载体PLKO.1/puro中;将上述质粒转染到293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染卵巢癌细胞A2780,实时定量PCR及Western blot检测CKS2表达;MTT法检测A2780细胞增殖;Western blot检测PARP-1的剪切;流式细胞术检测凋亡。结果成功构建CKS2 shRNA慢病毒表达载体能明显降低A2780细胞中CKS2 mRNA及蛋白表达(P0.05);能显著抑制A2780靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;感染A2780细胞后,细胞增殖受抑(P0.05);能诱导PARP-1蛋白的剪切及凋亡(P0.05)。结论成功构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,能显著抑制A2780细胞增殖。     

CIP2A shRNA真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的构建靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒并探讨其对胃癌细胞增殖的调节作用。方法根据siRNA原理设计4对靶向CIP2A的siRNA序列,克隆到真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中(shRNA-1、2、3和4)。脂质体转染人胃癌细胞系BGC-823,real-time PCR和Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA表达质粒,CCK-8法检测对胃癌细胞增殖的影响。结果 4个靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒经限制性酶切和测序证实基因已正确插入,转染效率可达到70%以上。转染后24、48和72 h,4个质粒均明显降低BGC-823细胞内CIP2A mRNA和蛋白的表达。相较于其他3个重组质粒,shRNA-1的抑制作用更为显著,且对胃癌细胞增殖有明显的抑制作用(P0.05)。结论成功构建的靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒,可有效抑制胃癌细胞CIP2A的mRNA和蛋白表达,并抑制胃癌细胞的增殖,为今后研究CIP2A在胃癌中的作用机制奠定了基础。     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

Construction of shRNA lentiviral vector

Lentiviruses have been adapted as gene delivery vehicles. This article summarized shRNA lentiviral vector methods generally used in research laboratories. The main procedures of shRNA lentiviral vector include that (1) Target sequences screening and shRNA oligonucleotides designing, (2) insert designed oligonucleotides into lentiviral vectors, (3) using packaging cells to produce shRNA lentivirus, and (4) transducing target cells with shRNA lentivirus.     

靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平.     

构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

BACKGROUND: Current research has shown that tumor necrosis factor α stimulated gene 6 (TSG-6) has anti-inflammatory effect, and the scar formation can be inhibited by local injection of TSG-6 protein at the early stage of trauma. However, the mechanism of this effect is still unclear. OBJECTIVE:To construct the lentiviral expression vector and shRNA vector for human TSG-6, with stable overexpression, transfection and interference, and to explore the effect of TSG-6 on proliferation and apoptosis of keloid fibroblast cell lines.  METHODS:Human keloid fibroblast cells were isolated from the keloid’s tissue by enzyme digestion and identified by immunocytochemistry assay. Lentiviral vectors pLVX-puro-TSG-6 and pLVX-shRNA1-TSG-6 were constructed and transfected into human keloid fibroblast, exclusively. Expression levels of TSG-6 mRNA and protein were detected by RT-PCR and western blot assay. MTT assay and flow cytometry were used to estimate the cell proliferation and apoptosis in each group after transfection. In addition, expression of Bcl-2, p53 and active-caspase-3 were detected by western blot assay in each group. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human keloid fibroblasts were separated successfully. Under the light microscope, cells were spindle. Immunohistochemical staining for vimentin was performed in the fifth passage of cells, with the positive rate of 100%. Cells were negative for cytokeratin. (2) Recombinant lentiviral vectors and stably transfected cell lines were successfully established. TSG-6 gene expression was altered apparently. Compared with the control group, cell proliferation was delayed and apoptotic rate was noticeably increased in TSG-6 gene overexpression group. Cell proliferation increased and apoptotic rate decreased in the TSG-6 gene intervention group (P < 0.05). (3) Western blot assay results demonstrated that Bcl-2 expression reduced, P53 and Active-caspase-3 expression significantly increased in the TSG-6 gene overexpression group (P < 0.05). (4) These finding showed that TSG-6 could inhibit proliferation and induce apoptosis in keloid fibroblasts. Its mechanism may be associated with the down-regulation of Bcl-2 protein expression, up-regulation of P53 protein expression and increased Caspase-3 activity. 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

CHK1shRNA抑制HeLa细胞增殖并诱导其凋亡

目的：构建针对CHK(checkpoint kinase，细胞周期检测点激酶)1基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA），观察其对高表达〖STBX〗CHK1〖STBZ〗的宫颈癌细胞系-HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响。方法：〖HTSS〗 设计并合成了针对CHK1的shRNA，将其导入本室构建的携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的RNAi（RNA interference，RNA干扰）表达载体中。通过 RT-PCR和Western blotting分别检测HeLa细胞CHK1基因和蛋白水平的表达，以流式细胞仪测细胞凋亡，MTT法检测细胞的增殖。结果：〖HTSS〗 成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1。与对照组和空载体转染组相比, shRNA使细胞中〖STBX〗CHK1〖STBZ〗 mRNA水平下降了66％，蛋白水平下降了60％。此外，shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显高于对照组，其增殖活性则明显低于对照组。结论：〖HTSS〗 本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况，且不影响H1启动子的体内转录。CHK1shRNA能诱导HeLa细胞凋亡，抑制该细胞的增殖，为进一步研究〖STBX〗CHK1〖STBZ〗在肿瘤治疗中的作用机制提供了实验基础。     

ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响

目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。     

VEGF_(165)真核表达载体的构建及其对白血病细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子的真核表达载体,探讨其对白血病细胞的增殖以及化疗药物敏感性的影响。方法:应用常规基因克隆方法构建pEGFP-C1-hVEGF165真核表达载体,转染白血病细胞K562,采用CCK8法检测重组质粒对细胞增殖的影响,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液和细胞内VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞周期。结果:经酶切鉴定和基因测序证实成功构建了VEGF165真核表达载体。稳定转染pEGFP-C1-hVEGF165的K562细胞较转染pEGFP-C1空质粒的K562细胞增殖加快,VEGF165 mRNA表达明显增加,细胞分泌VEGF蛋白水平上调。转染pEGFP-C1-hVEGF165还可以提高白血病细胞在化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶作用时的细胞存活率。结论:VEGF165真核表达载体可以上调白血病细胞K562的VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达水平,从而促进白血病细胞的增殖,同时可以降低白血病细胞对化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶的敏感性。     

人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率。用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响。结果获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3)。经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%。K562-plk3-pu-roR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异。与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0~G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)%vs(43.9±2.34)%,P=0.03]。以无血清培养基培养10h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)%vs(54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)%vs(3.4±0.37)%,P=0.01]。结论构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期。     

骨桥蛋白基因真核表达载体构建及对结肠癌细胞的作用

目的：构建骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）基因真核表达载体,转染人结肠癌细胞SW480,分析其对SW480细胞株增殖及生存能力的作用。方法：构建重组表达载体pEGFP-N1/OPN,经测序鉴定无误后,转染人结肠癌SW480细胞。RT-PCR检测SW480细胞转染后OPN mRNA表达;Western blot检测SW480细胞转染后OPN蛋白表达量;Cell Counting Kit-8（CCK-8）测定细胞增殖;软琼脂克隆形成实验观察细胞的锚定非依赖性生长能力。结果：pEGFP-N1/OPN转染SW480后,OPN基因获得很好转录,OPN蛋白表达增高,转染OPN后SW480细胞增殖率（光吸收值）显著高于转染阴性组（P〈0.05）,软琼脂克隆形成速度增快,数量明显多于对照组和空载体组（P〈0.05）。结论：OPN基因真核表达载体pEGFP-N1/OPN构建成功,OPN具有促进SW480细胞增殖、存活的作用,为进一步研究OPN作用机制奠定了重要基础。     

抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的：构建细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因的真核表达载体并分析其对乳腺癌细胞增殖的抑制效应。方法：利用PCR技术和分子克隆技术，构建编码细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因（AD5N）的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，利用脂质体介导法转染MCF-7细胞，RT-PCR、间接免疫荧光、Westernblot和流式细胞术分析该胞内抗体基因ADSN在MCF-7细胞中的表达、定位及抑瘤效应。结果：经限制性内切酶分析及序列分析发现，成功构建编码细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体（AD5N）基因的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，基因片段为855bp，编码285个氨基酸，分子量约为30kD。RT-PCR、免疫荧光及Westernblot实验结果显示，仅在转染胞内抗体基因的MCF-7细胞中存在该胞内抗体的表达，并且主要分布在细胞核区域。与野生型MCF-7细胞和转染空质粒的细胞相比，在MCF-7／pcDNA3．1-ADSN细胞中ADSN的表达可明显抑制MCF-7细胞增殖，显著诱导细胞凋亡（P〈0．01），使G0-G1期细胞周期指数增高12．64％，S期指数下降15．22％，凋亡细胞指数上升9．15％。结论：细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体ADSN基因的表达，可有效抑制乳腺癌细胞的增殖，阻滞细胞周期进展，并诱导细胞凋亡。     

CD147 shRNA质粒表达载体的构建及鉴定

目的构建表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147,EMMPRIN)基因序列特异性的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体。方法根据CD147基因序列及shRNA设计原则,化学合成两段编码短发夹RNA寡核苷酸序列,将其定向克隆到pGenesil-1.1质粒表达载体中,重组构建RNAi质粒,并对重组质粒进行酶切分析。结果限制性内切酶Eco31I和SacI酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1.1质粒载体中,酶切结果证实插入片段与设计序列完全一致,成功构建针对基因CD147的shRNA质粒表达载体。结论成功构建人CD147基因重组载体,为研究CD147蛋白的生物学效应和骨肉瘤的治疗提供实验依据。     

人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导

目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验。用显微镜观察转导效率,用Westernblot检测RNA干扰效果。结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好。结论:成功构建出慢病毒hNDUC RNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞。     

靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

P53 shRNA对肝癌细胞增殖的影响

 目的 观察用RNA干扰（RNAi）下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响。方法 设计合成P53基因的短发夹RNA（shRNA）,并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒。重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆。克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达。BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重。结果 P1、P2、P3三条P53 shRNA均可明显降低P53 mRNA水平（P<0.05, P<0.05, P<0.01）;干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率（P<0.05）,P21 mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低（P<0.05）。P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量（P<0.05）。结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpin RNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF1)基因的沉默效果.方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1.以人HIF1 cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1.新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变.结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降.结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义.