miR-494慢病毒表达载体的构建

目的:构建miR-494基因的慢病毒表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增hsa-miR-494基因,用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切携带EGFP的慢病毒载体pGIPZ,酶切产物电泳后回收约11kb的载体片段。使用DNA连接试剂盒中的Solution I将其与miR-494连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR-494测序,所构建载体命名为pGIPZ-miR-494-eGFP,获pGIPZ-miR-494-eGFP后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产。将慢病毒颗粒以最适滴度感染人体肺腺癌细胞株A549,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用Real-Time PCR检测感染效率。结果:目的基因与慢病毒载体连接成功。共转染293T细胞包装病毒与浓缩后滴度达1.02×108TU/ml,并转染到肺腺癌细胞株A549上,Aldefluor流式分选出的细胞后通过Real-Time PCR检测结果显示miR-494慢病毒表达载体感染的A549细胞miR-494表达高于对照组达10倍以上。结论:成功构建携带人miR-494基因的慢病毒表达载体pGIPZ-miR-494-eGFP,为相关后续研究打下了良好基础。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的：构建白细胞介素7（IL-7）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法：将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果：pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论：pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础。方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体。通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达。结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac I线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac I线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP。将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达;通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达。结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础。     

红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010pfu/ml。结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

胰岛素启动子在肝干细胞分化研究中的应用

目的：利用报告基因监测肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。方法：通过PCR从大鼠鼠尾基因组中克隆胰岛素启动子片段,构建大鼠胰岛素Ⅰ启动子调控的红色荧光蛋白报告载体（pRIP Ds Red）,并利用报告载体标记的肝原始细胞系（liver epithelialprogenitor cells,LEPCs）及经逆转录病毒感染后表达MafA的肝原始细胞系（LEPCs-MafA）,观察肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。结果：获得胰岛素启动子调控的报告载体、报告载体标记的LEPCs及LEPCs-MafA。结论：pRIP DsRed报告载体的成功构建为研究LEPCs向胰腺细胞的转分化提供了简捷的分子工具。     

慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达

目的：探讨慢病毒系统介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的过表达,为进一步研究LKB1基因在子宫内膜癌的作用机制奠定基础。方法以PCR扩增LKB1克隆质粒获得全长cDNA,将LKB1 cDNA链接到慢病毒载体pWPI,构建慢病毒表达质粒LKB1/pWPI。通过与包装质粒pCMV-Dr8.74和pMD2.G共转染293T细胞进行病毒包装,用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,以荧光定量PCR、Western blot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量。结果成功扩增LKB1全长cDNA和构建LKB1重组慢病毒表达载体LKB1/pWPI。转染包装293T细胞后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞HEC-1A。转染后HEC-1A-LKB1-pWPI细胞中LKB1的表达率明显高于亲本细胞和空白对照细胞（P〈0.01）。结论成功构建携带LKB1基因的慢病毒表达载体,包装病毒后能有效地感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,为进一步探讨LKB1基因在子宫内膜癌中的生物学效应奠定了基础。     

人类mir-7-3基因慢病毒表达载体的构建及其在胶质瘤中的表达

目的 构建人类mir-7-3基因慢病毒表达载体,为进一步研究mir-7-3基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法 采用反转录-聚合酶链(RT-PCR)技术从含有mir-7-3基因的质粒pENTR-MIRNA VECTOR扩增目的 基因mir-7-3,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-RNAiVECTOR[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-mir-7-3,酶切、测序验证mir-7-3基因后,将Lenti-GFP-mir-7-3质粒和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共同转染人类胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带mir-7-3基因和EGFP基因的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和人类胶质瘤细胞U251,荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定U251细胞中mir-7-3基因的表达水平.结果 Lenti-GFP-mir-7-3共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒FTV-CMV-EGFP-mir-7-3,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,FIV-CMV-EGFP-mir-7-3中携有正确的mir-7-3基因,目的 基因mir-7-3能被重组慢病毒高效地转导人U251.结论 成功构建了携带mir-7-3基因的重组慢病毒载体;为进一步从分子水平探讨mir-7-3基因治疗胶质瘤奠定了基础.     

人类mir-7-3基因慢病毒表达载体的构建及其在胶质瘤中的表达

目的 构建人类mir-7-3基因慢病毒表达载体,为进一步研究mir-7-3基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法 采用反转录-聚合酶链(RT-PCR)技术从含有mir-7-3基因的质粒pENTR-MIRNA VECTOR扩增目的 基因mir-7-3,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-RNAiVECTOR[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-mir-7-3,酶切、测序验证mir-7-3基因后,将Lenti-GFP-mir-7-3质粒和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共同转染人类胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带mir-7-3基因和EGFP基因的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和人类胶质瘤细胞U251,荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定U251细胞中mir-7-3基因的表达水平.结果 Lenti-GFP-mir-7-3共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒FTV-CMV-EGFP-mir-7-3,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,FIV-CMV-EGFP-mir-7-3中携有正确的mir-7-3基因,目的 基因mir-7-3能被重组慢病毒高效地转导人U251.结论 成功构建了携带mir-7-3基因的重组慢病毒载体;为进一步从分子水平探讨mir-7-3基因治疗胶质瘤奠定了基础.     

人类mir-7-3基因慢病毒表达载体的构建及其在胶质瘤中的表达

 目的　构建人类mir-7-3基因慢病毒表达载体,为进一步研究mir-7-3基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用奠定基础。方法　采用反转录-聚合酶链（RT-PCR）技术从含有mir-7-3基因的质粒pENTR-MIRNA VECTOR扩增目的基因mir-7-3,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-RNAi VECTOR [含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因]中,构建慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-mir-7-3,酶切、测序验证mir-7-3基因后,将Lenti-GFP-mir-7-3质粒和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共同转染人类胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带mir-7-3基因和EGFP基因的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP- mir-7-3,取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和人类胶质瘤细胞U251,荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定U251细胞中mir-7-3基因的表达水平。结果　Lenti-GFP-mir-7-3共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,FIV-CMV-EGFP-mir-7-3中携有正确的mir-7-3基因,目的基因mir-7-3能被重组慢病毒高效地转导入U251。结论　成功构建了携带mir-7-3基因的重组慢病毒载体;为进一步从分子水平探讨mir-7-3基因治疗胶质瘤奠定了基础。