THANK重组腺病毒肝癌基因治疗的实验研究

目的 在构建THANK腺病毒载体的基础上，在裸鼠体内观察THANK基因转移对SMMC-7721细胞作用。方法 用THANK重组腺病毒，感染SMMC-7721细胞，获取高表达THANK基因的7721细胞，将不同7721细胞接种裸鼠，观察THANK基因转移后7721细胞的成瘤性变化，包括肿瘤生长的大小、速率，肿瘤重量、裸鼠生存期变化以及成瘤后肿瘤组织及脾脏的微观结构变化。结果 THANK在7721细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的生长，激发机体的抗肿瘤免疫，抑制初次和再次接种的亲代7721细胞的生长，降低了7721细胞的成瘤性。光镜和电镜观察均可发现THANK的转染使得7721细胞的坏死和凋亡比例有所增高，提示THANK在裸鼠体内可能通过某种机制增强了7721细胞的凋亡比例。结论 THANK在裸鼠体内可诱发有效的抗肿瘤免疫。     

双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用

目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE;在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％;48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达;与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05];CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.     

腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响

目的 研究腺病毒介导的多种基因在肝癌细胞中的表达和对肝癌细胞生长的影响。方法 构建含人ｐ５３、Ｂ７－１、ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体,感染３种肝细胞癌细胞系和肝细胞系Ｌ０２,运用ＥＬＩＳＡ、免疫组化、流式细胞仪等方法,检测目的基因在肝癌细胞中的表达,和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果 肝癌细胞对腺病毒高度易感,腺病毒多重感剂量为５０（５０ＭＯＩ时）,可使９０％左     

乙肝病毒L颗粒作为肝癌靶向性基因治疗载体的研究

目的 评估乙肝病毒L蛋白颗粒作为一种新型肝癌靶向性基因治疗转运载体的可行性.方法 通过电穿孔方法(电压=400 V,脉冲时间=60 us,pGFP:L颗粒=4:10)将绿色荧光表达质粒pGFP导入乙肝病毒L颗粒,形成的L/pGFP颗粒转染各种肝来源细胞株以及非肝来源细胞株,以脂质体作为对照转染相同细胞株,荧光湿微镜检测各细胞株基因转运效率.结果 L/pG-FP颗粒对各种肝来源细胞株均保持较高的转染效率.对正常肝来源细胞L02的转染效率(67.0±2.6)%低于肝癌细胞株HepG2(75.0±3.5)%和7721(72.0±2.3)%,然而均显著高于脂质体的转染效率(P<0.05).非肝来源的乳腺癌细胞株MCF-7不能被L/pGFP颗粒有效转染.未接受电穿孔的L颗粒+pGFP混合液不能有效转染任何细胞株.结论 L颗粒能特异性、高效转运外源性基因至各种肝来源细胞,可作为一种安全高效的靶向性转运载体用于肝癌的基因治疗.     

白细胞介素12对肝癌基因治疗的实验研究

目的 研究携带白细胞介素１２（ＩＬ－１２）基因逆转录病毒载体对体内肝癌生长抑制作用,探索基因治疗肝癌新途径。方法 构建携带ＩＬ－１２的逆转录病毒载体,转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７,应用该包装细胞对实验性肝癌大鼠进行治疗,观察抗肿瘤作用,免疫功能变化。     

原发性肝癌基因治疗目的基因筛选的初步研究

目的 通过动物实验初步筛选对肝癌有明确疗效的目的基因。方法 应用携带对肿瘤有明确疗效的目的基因白细胞介素－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２,ＩＬ－２）,白细胞介素－１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２,ＩＬ－１２）,共刺激因子Ｂ７－１（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ,Ｂ７－１,Ｂ７－１）,单纯疱疹病毒胸苷激素（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ－１ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ,ＨＳＶ－ＴＫ）,抑癌基因Ｐ５３     

核转录因子NF-κB在TRAIL诱导肝癌细胞凋亡中作用的研究

目的初步探讨核转录因子NF-κB在TRAIL诱导肝癌细胞发生凋亡过程中的作用和可能机制。方法应用流式细胞仪技术检测经TRAIL和(或)MG-132处理后,肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生情况;采用蛋白印渍技术检测TRAIL处理后SMMC-7721细胞凋亡相关蛋白表达情况;并用ELISA法检测NF-κB活性变化。结果单独使用TRAIL后,肝癌细胞发生凋亡,其凋亡指数为15．1％;若联合应用NF-κB抑制剂-MG-132后,则凋亡指数达27．4％,明显高于前者(P<0．01);同时,两者均高于对照组(P<0．01)。SMMC-7721细胞经TRAIL处理后,抗凋亡蛋白表达增加,而促凋亡蛋白表达下降。另外,经TRAIL单独处理后,细胞的NF-κB活性(0．49±0．02)明显高于其余各组(P<0．01)。结论NF-κB在TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡过程中被激活,而NF-κB又可能通过促进抗凋亡蛋白的表达、抑制促凋亡蛋白的表达,从而抑制肿瘤细胞的凋亡。     

重组腺病毒介导TIMP-1基因对肝癌的治疗作用

目的探讨携带人基质金属蛋白酶组织抑制因子(hTIMP)-1的重组腺病毒(Adh- TIMP)-1对人肝癌生长、转移、血管形成以及凋亡的作用。方法构建AdhTIMP-1感染人肝癌细胞并接种于裸鼠皮下观察其成瘤情况;建立荷瘤鼠模型,观察AdhTIMP-1对肿瘤生长的作用;计数荷瘤鼠肺转移结节;CD34免疫组织化学观察肿瘤血管生成;TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。结果AdhTIMP-1感染的HepG2细胞成瘤量下降4倍(P<0．01),荷瘤鼠瘤体内注射AdhTIMP-1使肿瘤生长减少45％(P<0．01),组织血管密度减少47％(P<0．05),肺转移结节减少70％(P<0．01),肿瘤组织中细胞凋亡增加3倍(P<0．05)。结论AdhTIMP-1能抑制肝癌的生长、转移及血管形成,诱导肝癌细胞凋亡,可用于肝癌基因治疗的研究。     

TRAIL的抗肝细胞癌作用研究

目的 探讨TRAIL对HCC的治疗作用。方法 用不同浓度TRAIL处理肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，观察经药物处理前后肿瘤细胞的凋亡发生率。采用分子克隆技术构建了真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL，转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞，观察其疗效。体内实验建立裸鼠肝癌模型，观察TRAn。的抑癌作用。结果TRAR，(100ng／m1)处理24h，肝癌细胞凋亡发生率约10％，而Jurkat细胞凋亡率达70％以上，胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射pIRES-EGFP-TRAIL可有效的导入TRAIL基因并获得高表达，但对裸鼠肝癌无明显抑制作用。结论 肝细胞癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象，提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素，单一的TRAIL疗HCC疗效有限。     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体治疗肝细胞癌的研究

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与其受体在肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)中的表达及意义,及利用TRAIL对HCC的治疗作用。方法采用免疫组化技术及原位杂交方法分别检测了100例肝癌组织,100例癌旁组织,40例正常肝组织中TRAIL及TRAILR的表达,并结合临床资料进行分析;采用不同浓度TRAIL处理肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,观察经药物处理前后肿瘤细胞的凋亡发生率。结果TRAIL在正常肝组织中无表达,癌旁组织中的表达明显高于癌组织。86例肝癌组织不表达诱捕受体DcR1(86%),55例肝癌组织不表达诱捕受体DcR2(55%),40例正常肝组织两种诱捕受体均有表达。肝癌组织中死亡受体为高表达,诱捕受体为低表达,正常肝组织则相反,两者间有显著差异性(P<0.05)。肝癌组织中死亡受体的表达与肿瘤的分化呈正相关(P<0.01),与肿瘤分级呈负相关(P<0.05),与病人的性别、年龄、AFP水平、肿瘤的大小以及是否转移无关。经TRAIL(100ng/ml)处理24h,肝癌细胞凋亡发生率约10%,而Jurkat细胞凋亡率达70%以上,胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50%。结论HCC时,TRAILR普遍表达,但存在受体类型的表达差异,其中DcR1大多缺失,这为利用TRAIL治疗HCC提供了理论依据,然而,单一的TRAIL治疗只能有限的诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721发生凋亡,HCC对TRAIL诱导的凋亡存在耐药现象。     

TRAIL及其受体在肝癌耐药株治疗中的作用

目的比较肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2的TRAIL受体的表达。及TRAIL对肝癌耐药株HepG2/ADM的治疗作用。方法通过浓度递增法用阿霉素处理人肝癌细胞株HepG2获得肝癌耐药株HepG2/ADM。RT-PCR、Western Blot和免疫组化比较肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2的TRAIL受体及bcl-2、MDR的mRNA和蛋白表达。采用AnnexinV-FITC-PI双染色流式细胞仪测TRAIL对肝癌耐药株HepG2/ADM的调亡诱导作用。结果肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2比较都存在DR4、DR5受体且mRNA和蛋白表达上无差异。DcR1、DcR2在蛋白表达上无差异,但mRNA水平有轻度变化,未达到统计显著性。免疫组化示肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2都存在DR4、DR5受体和DcR1、DcR2受体,分析未见差异。TRAIL对HepG2/ADM及其亲代均有诱导调亡的作用,同样存在一定的耐受现象。但调亡作用两者无显著性差异。结论肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2都存在DR4、DR5受体和DcR1、DcR2受体。表达无显著性差异。单纯TRAIL治疗对耐药株作用与亲代细胞作用相仿,虽同样存在一定的耐受现象,但受HepG2/ADM耐药性的影响小。TRAIL治疗肝癌耐药株有优势。     

携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体外研究

目的 应用成功制备的携带人Fas基因的两种重组腺病毒，感染瘢痕疙瘩(keroid，K)成纤维细胞(fibroblasts，FB)，使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白，并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 腺病毒感染KFB后，检测及比较两种腺病毒转染前后，KFB内Fas蛋白的表达变化、蛋白功能以及细胞增殖-凋亡状况。结果 腺病毒感染后的KFB均能稳定提高Fas蛋白的表达，并且在Fas单克隆抗体的诱导下可以发生明显的细胞凋亡。结论 ①构建的两种重组腺病毒Ad-Fas在体外实验中能有效地提高KFB蛋白的表达，并可以重建原来阻断的死亡信号传导通道；②细菌内重组腺病毒体外治疗效果更佳；⑧再次估证了Fas基因突变与K之间的联系，为K基因治疗展示了一条新途径。     

ATX-shRNA表达质粒对肝癌细胞体外增殖和运动能力的影响

目的 研究ATX基因短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体对人MHCC-97肝癌细胞ATX基因表达和增殖、运动能力的抑制作用.方法 应用RT-PCR检测转染后肝癌细胞ATX mRNA的表达,同时应用MTT、细胞运动、侵袭实验检测其对人MHCC-97肝癌细胞增殖、侵袭、运动能力的影响.结果 ATX-shRNA表达载体可以有效的抑制人MHCC-97肝癌细胞中ATX基因的表达,使ATX基因的mRNA表达量显著下降,以转染后第四天下降最明显,并且转染后细胞增殖、侵袭、运动能力均减弱.结论 ATX-shRNA表达载体能有效地抑制ATX基因表达.     

肝细胞癌中APC基因启动子甲基化和mRNA表达检测

目的探讨肝细胞癌中APC基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测30例肝细胞癌及相应的癌旁组织和10例正常对照肝组织中APC基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析甲基化与临床资料以及与mRNA表达的关系。结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到APC基因启动子甲基化率分别是46.6%、16.6%、0%。肝细胞癌组织中APC基因启动子甲基化率明显高于相应的癌旁和对照组(P<0.05),并且与年龄和癌肿有无假包膜有相关性(P<0.05)。各组织中APC基因mRNA表达无显著差异。结论APC基因启动子甲基化与肝细胞癌形成和侵袭有关,但不影响癌组织中mRNA表达。     

原发性肝细胞癌中细胞周期G1期相关基因Cyclin D1的表达及其临床病理学意义

目的研究原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）中ＣｙｃｌｉｎＤ１基因的表达及其与ｐ５３基因、肝癌细胞增殖活性的关系,探讨其在ＨＣＣ的发生、发展中可能的作用。方法应用免疫组织化学及定量ＤＮＡ图像分析的方法,检测ＣｙｃｌｉｎＤ１、Ｐ５３基因在３２例ＨＣＣ和６例正常肝组织中的表达,并分析ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白的表达与肝癌细胞增殖活性的关系。结果肝癌组织中ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白的过表达率明显高于癌旁肝组织（７１．８％,２３／３２对０％,０／３２;Ｐ＜０．０１）。ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白的表达与ＨＣＣ的Ｐ５３基因表型状况及其它临床病理学指标无关。ＨＣＣ中Ｓ期细胞比例在不同ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白水平的ＨＣＣ中未见显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结论ＣｙｃｌｉｎＤ１基因的过度表达可能参与ＨＣＣ的发生、发展。ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白的免疫组化染色可作为ＨＣＣ的辅助病理学诊断指标之一。     

肝细胞癌中SLIT2基因甲基化状态研究

目的 SLIT2基因甲基化已在多种肿瘤中被发现,我们拟了解肝细胞癌(HCC)中SLIT2基因的甲基化状态及临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术,检测50例HCC癌组织及相应的癌旁组织,4个HCC细胞系, 8例肝血管瘤旁和4例供肝组织,了解SLIT2基因在上述组织中的甲基化状态,并分析其与临床资料间的相关性。结果 8例肝血管瘤旁和4例供肝组织均未发生甲基化,4个HCC细胞系有3个出现甲基化。50例HCC癌组织及其相应的癌旁组织中, 分别检测到39例(78％)和26例(52％)发生甲基化;癌组织与癌旁组织甲基化率比较,有显著统计学差异(P=0．006);TNM Ⅲ期组SLIT2甲基化率高于TNM Ⅰ／Ⅱ期组(P=0．035);甲基化阳性组的半年无瘤生存率低于阴性组,但差异无统计学意义 (P=0．208)。结论 SLIT2基因甲基化是HCC中的频发事件,可能参与HCC的发展。     

人肝细胞癌中促凋亡基因bax的原位检测及其临床意义

目的 研究促凋亡基因ｂａｘ在人肝细胞（ＨＣＣ）中的表达及其意义。方法 采用化学和原位杂交方法检测石蜡包埋的人ＨＣＣ标本中基因ｂａｘ的表达。结果 在免疫组织化学检测的４０例人ＨＣＣ中,ｂａｘ阳性１９例;１４例肝硬变组织中,ｂａｘ阳性１１例;ｂａｘ在ＨＣＣ中的表达低下肝硬变;高、中分化型ＨＣＣ的ｂａｘ表达高于低分化型,而且ＡＦＰ≤４００μｇ／Ｌ的患者ｂａｘ表达高于ＡＦＰ〉４００μｇ／Ｌ的患者,ＨＣＣ临     

肝细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达的研究

目的 探讨细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录-聚合酶链反应技术,检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中WIF-1基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析上述组织WIF-1基因甲基化及mRN表达与临床资料的关系并分析甲基化对mRNA表达的影响。结果 WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织（Х^2=4．89,P〈0．05）,而癌旁组织和正常组织中WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中WIF-1基因甲基化与乙肝表面抗原、肝硬化有关;WIF-1基因mRNA表达量在三种组织中比较无明显差异。结论 WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;WIF-1基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系有待进一步研究。     

原发性肝癌中CDKN2/P16基因突变的研究

目的 阐明ＣＤＫＮ２／Ｐ１６基因突变与原发性肝癌发生的关系。方法 采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＰＣＲ产物直接银染测序技术，对３０例原发性肝癌组织中ＣＤＫＮ２／Ｐ１６基因第二外显子进行突变检测。结果 检出２例（２／３０）ＣＤＫＮ２基因突变，均是位于第１２４位密码子的错义突变。结论 ＣＤＫＮ２基因的突变虽不频发，但在原发性肝癌的发生中起了一定作用。