肝细胞生长因子阻抑TGF-β1诱导大鼠韧带成纤维细胞?琢-SMA过表达及其机制

目的：研究肝细胞生长因子（HGF）能否阻抑TGF-β1诱导的大鼠内侧副韧带（MCL）成纤维细胞?琢-SMA过表达及其可能涉及的信号传导通路。方法：采用组织块培养法培养大鼠MCL成纤维细胞,培养液中加入TGF-β1(5ng/ml)及HGF (10—40 ng/ml)。培养72h后,用RT-PCR检测各组?琢-SMA mRNA及Smad3 mRNA的变化;细胞免疫组化检测?琢-SMA蛋白的表达。结果：TGF-β1能显著诱导?琢-SMA及Smad3的表达(P<0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P<0.05)。结论：HGF可以通过下调Smad3的表达来阻抑TGF-β1诱导的?琢-SMA过表达。这为利用HGF预防和治疗MCL损伤后瘢痕及纤维化在细胞和分子水平提供了依据。     

α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂对TGF-β1介导的血管外膜成纤维细胞表型转化影响的体外研究

目的 :探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAchR)与血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts, AF)表型转化间的关系。方法:选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,用组织切块法培养其胸主动脉外膜AF。为评估转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)刺激AF表型转化的作用,将体外培养的AF分为空白对照组A、TGF-β1处理24 h组和TGF-β1处理48 h组3组,处理结束后分别应用实时定量PCR和免疫印迹试验,检测相α7 nAchR基因和蛋白的表达以及α-肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原的表达情况。为进一步探讨α7 nAchR的激活能否抑制TGF-β1刺激表型转化及其分子机制,另将体外培养的AF分为空白对照组B、TGF-β1处理48 h组及TGF-β1处理48 h合并α7 n AchR激活剂PNU-282987处理组3组,处理48 h后用免疫印迹法检测α-SMA和Ⅰ型胶原的表达及细胞外调节蛋白激酶1/2 (extracellular regulated protein kinases1/2, Erk1/2)磷酸化情况。结果 :与空白对照A相比,TGF-β1可使α7 n AchR的基因和蛋白表达明显降低(P0.05),同时TGF-β1可使α-SMA和Ⅰ型胶原的表达明显增加(P0.05)。α7 nAchR激动剂PNU-282987可抑制TGF-β1刺激的AF中α-SMA和Ⅰ型胶原的表达,亦可抑制TGF-β1刺激的Erk1/2磷酸化。结论:α7 nAchR的抑制参与TGF-β1介导的血管AF表型转化,其机制可能与Erk1/2磷酸化有关。     

IPL对TGF-β1介导成纤维细胞增殖的影响及ERK抑制剂作用

目的探讨强脉冲光(IPL)照射对TGF-β1介导的成纤维细胞增殖及细胞外ERK表达的影响。方法利用包皮组织(包皮环切获得)体外分离培养原代成纤维细胞。实验分为两个部分:第一部分:使用不同浓度的TGF-β1,即0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/m1、1.0ng/ml、10.0ng/ml及50.0 ng/ml分别处理成纤维细胞。(2)第二部分:按照下列情况分组:TGF-β11.0ng/ml组、10.0ng/ml组、 PD98059+72J/cm2组、PD98059+TGF-β110.0ng/ml组、PD98059+72J/cm2+TGF-β110.0ng/ml组、IPL72J/cm2组、IPL 72J/cm2+TGF-β110.0ng/ml组、阴性对照组,处理细胞后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况、采用Western Blot法测定p-ERK的变化。结果第一部分:不同浓度的TGF-β1分别处理24及48小时后,与未照射组比较, TGF-β1浓度为10.0ng/ml时,细胞增殖活性显著增高(P0.05)。第二部分:与阴性对照组相比:IPL 72J/cm2组和72J/cm2+TGF-β110ng/ml组成纤维细胞增殖活性明显增加(P0.01),但PD98059+TGF-β110ng/ml及PD98059+72J/cm2较对照组细胞增殖活性减少(P0.05);各组p-ERK表达水平较对照组均有增加,但与72J/cm2组比较,加入PD98059的组其p-ERK表达均有降低。结论体外实验证实强脉冲光及TGF-β1可促进成纤维细胞增殖活性,其机制可能是通过ERK信号通路介导完成。     

白细胞介素-1β在人肾小管上皮细胞转分化中的作用及Janus激酶2抑制剂AG490的影响

目的 探讨Janus激酶2抑制剂AG490对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响. 方法 将体外培养人肾近曲小管上皮细胞株(HKCs)分为空白对照组、IL-1β(5 ng/ml)刺激组及AG490干预组(IL-1β 5 ng/ml+AG490 10 μmol/L).分别于处理后24、48、72 h收集细胞,采用免疫细胞化学染色和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测细胞角蛋白-18(CK-18)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达. 结果 正常肾小管上皮细胞内其自身标志物CK-18高表达(1.25±0.08),而α-SMA表达很少(0.17±0.01).IL-1β刺激组随刺激时间延长CK-18表达逐渐减少(24 h:0.69±0.04,48 h:0.52±0.03,72 h:0.30±0.01),而α-SMA蛋白合成逐渐增加(24 h:0.56±0.04,48 h:1.05±0.07,72 h:1.43±0.07),与空白对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).AG490干预能使CK-18的表达逐渐恢复(24 h:1.07±0.07,48 h:0.93±0.06,72 h:0.83±0.06),并减弱IL-1β对肾小管上皮细胞α-SMA蛋白的诱导作用(24 h:0.33±0.01,48 h:0.52±0.01,72 h:0.61±0.04),且作用显著(均P＜0.05).免疫细胞化学染色观察结果与其一致. 结论 炎症因子IL-1β通过降低肾小管上皮细胞CK-18表达,上调α-SMA表达,促使肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞;Janus激酶2抑制剂AG490能部分阻断IL-1β对肾小管上皮细胞的促转分化作用.     

核心蛋白多糖对TGF-β1促Tenon囊成纤维细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)促进Tenon囊成纤维细胞的增殖作用及核心蛋白多糖(decorin)对TGF-β1促Tenon囊成纤维细胞增殖的影响。方法:(1)取青光眼患者的Tenon囊组织,采用组织块贴壁培养法进行原代培养细胞培养,细胞经过冷冻与复苏后,观察细胞形态结构与生物学特性。(2)用不同浓度(0.01、0.1、1、5、10ng/mL)TGF-β1作用于Tenon囊成纤维细胞48h。(3)终浓度为5ng/mL的TGF-β1和不同浓度(0.01、0.1、1、2、5μg/mL)的decorin共同作用于Tenon囊成纤维细胞48h。MTT比色法检测Tenon囊成纤维细胞增殖。结果:(1)体外成功培养Tenon囊成纤维细胞,细胞生长活跃,形状稳定,细胞经过冷冻与复苏后,仍能保持其原来的细胞形态结构与稳定的生物学特性。(2)1～10ng/mLTGF-β1能促进Tenon囊成纤维细胞的增殖,并与浓度成正比。(3)2～5μg/mLdecorin能抑制TGF-β1促Tenon囊成纤维细胞增殖作用,其抑制作用与浓度成正比。结论:TGF-β1可刺激Tenon囊成纤维细胞增殖,Decorin能抑制TGF-β1促进细胞增殖的作用,其机理可能通过与TGF-β1结合抑制青光眼滤过手术后瘢痕形成。     

TGF-β2对豚鼠实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞的增殖和超微结构的影响

目的明确转化生长因子β2(TGF-β2)对豚鼠镜片诱导型近视眼后极部巩膜成纤维细胞的增殖和超微结构的影响。方法选择2周龄豚鼠10只,随机选取一只眼(实验组)用镜片诱导法制备近视动物模型,对侧眼为自身对照组。造模30 d后对两组进行屈光度和眼轴检测。培养豚鼠后极部巩膜成纤维细胞。将每只眼培养的细胞分为空白对照及TGF-β21、10、100 ng/ml浓度组,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组光吸收值(OD)和细胞增殖的程度;利用电镜观察TGF-β210 ng/ml时细胞的超微结构并对结果进行统计分析。结果凹透镜诱导后实验组屈光度和眼轴与诱导前比较差异均有统计学意义(P<0.05);实验组和自身对照组TGF-β2 100 ng/ml时OD值与空白对照比较差异无统计学意义(P>0.05),TGF-β2 1、10 ng/ml和空白对照两两比较差异有统计学意义(P<0.05),同浓度TGF-β2组间OD值和增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度TGF-β2时细胞增殖率组内比较差异有统计学意义(P<0.05)。在10 ng/ml TGF-β2作用下巩膜成纤维细胞核外形不规则,粗面内质网扩张,细胞器减少,细胞界膜不清,部分界膜消失。结论 TGF-β2可有效地抑制豚鼠巩膜成纤维细胞的增长,其中10 ng/ml的刺激作用最强,可使细胞的超微结构发生变化。     

白细胞介素-1β对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E_2表达的影响

目的 研究白细胞介素-1β(IL-1β)对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E_2(PGE_2)表达的影响,以探讨其在吸入性损伤修复中的作用.方法 分离雄性昆明种小鼠的气道成纤维细胞并进行体外培养,分别收集不同浓度的IL-1β作用后不同时间点IL-1β的培养上清液及细胞;采用酶联免疫吸附试验法和West-ern blot技术测定PGE_2水平,环氧化酶-2(COX-2)、膜相关前列腺素E_2合成酶1(mPGES1)蛋白表达.结果 ①经IL-1β 1.0μg/L处理后不同时间点气道成纤维细胞培养上清液PGE_2水平在8 h[(148.2±28.3)ng/L]、16 h[(267.6±45.4)ng/L]、24 h[(210.5±38.6)ng/L]、48 h[(198.7±36.5)ng/L]均高于各对照组[分别为(57.8±15.3)、(58.2±15.7)、(57.9±15.8)、(58.1±16.1)ng/L],差异均有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点水平最高;气道成纤维细胞COX-2表达在8 h[(0.478±0.029)COX-2/β-actin、16 h(0.672±0.047)COX-2/β-actin、24 h(0.617±0.036)COX-2/β-actin、48 h(0.593±0.034)COX-2/β-actin]均高于对照组[(0.309±0.019)COX-2/β-actin、(0.311±0.019)COX-2/β-actin、(0.309±0.019)COX-2/β-ac-tin、(0.310±0.018)COX-2/β-actin],差异有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点表述水平最高;气道成纤维细胞mPGES1的表达在8 h(0.300±0.018)mPGES1/β-actin、16 h(0.549±0.034)mPGES1/β-actin、24h(0.497±0.030)mPGES1/β-actin、48 h(0.443±0.026)mPGES1/β-actin均高于各对照组[(0.199±0.012)、(0.201±0.013)、(0.200±0.013)和(0.200±0.022)mPGES1/β-actin],差异有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点表达水平最高.②不同浓度IL-1β处理气道成纤维细胞后,气道成纤维细胞培养上清液PGE_2水平在IL-1β 0.1 μg/L组[(242.9±22.3)ng/L]、1.0μg/L组[(267.6±45.4)ng/L和10.0μg/L组[(587.3±106.9)ng/L]均高于对照组[(58.5±16.0)ng/L],差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.01);气道成纤维细胞COX-2表达在IL-1β 0.1μg/L组(0.525±0.032)ng/L、1.0μg/L组(0.672±0.047)ng/L和10.0μg/L组(1.022±0.064)ng/L均高于对照组(0.309±0.019)ng/L,差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.02);气道成纤维细胞mPGES1表达在IL-1β 0.1μg/L组(0.380±0.021)ng/L、1.0μg/L组(0.549±0.034)ng/L和10.0μg/L组(0.879±0.045)ng/L均高于对照组(0.199±0.022)ng/L,差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.01).结论 炎症递质IL-1β可上调气道成纤维细胞PGE_2水平、COX-2和mPGES1表达,这表明IL-1β可能是通过COX-2和mPGES1的表达来影响PGE_2合成,从而参与气道吸入性损伤修复过程.气道成纤维细胞可能是损伤修复过程中炎症递质的主要来源细胞之一.     

白细胞介素1β对气道成纤维细胞PGE2EP2及15-PGDH表达的影响

目的 研究白细胞介素-1β(IL-1β)对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E2(PGE2)、前列腺素E2受体(EP2)及15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)表达的影响,以探讨其在吸入性损伤修复中的作用.方法 分离雄性昆明种小鼠的气道成纤维细胞并体外培养,分别收集IL-1β作用后不同时间点和不同浓度的培养上清液及细胞;采用ELISA 法测定PGE2水平,western blot测定EP2及15-PGDH蛋白表达.结果 ①经IL-1β 1 ng/mL处理后气道成纤维细胞培养上清液PGE2水平在8、16、24、48 h均高于对照组(P<0.01),其中16 h水平最高;而EP2及15-PGDH蛋白表达在8、16、24、48 h与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).②不同浓度IL-1β处理气道成纤维细胞后,气道成纤维细胞培养上清液PGE2水平在IL-1β 0.1 ng/mL 组、1 ng/mL组和10 ng/mL组均高于对照组(P<0.01),并且三组比较差异有统计学意义(P<0.01);而EP2及15-PGDH蛋白表达在IL-1β 0.1 ng/mL组、1 ng/mL组和10 ng/mL组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 炎症介质IL-1β可上调气道成纤维细胞PGE2水平,而对EP2、15-PGDH的表达无影响.表明IL-1β并不是通过EP2及15-PGDH蛋白表达来影响PGE2的合成,参与气道吸入性损伤修复过程.     

转化生长因子β1对培养的瘢痕成纤维细胞挛缩功能的作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞诱导肌动蛋白(α-actin)和粘连蛋白(FN)表达的作用,探讨TGF-β1与烧伤瘢痕挛缩的关系.方法采用细胞培养、ELISA法、免疫组化、图像分析技术,观察在不同TGF-β1含量作用下,瘢痕成纤维细胞α-actin和FN表达的情况.结果不同含量TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-actin和FN的作用不同,以10～50 μg/L的TGF-β1作用最有效;与对照组相比,实验组的成纤维细胞表达更明显,差异均有显著性意义.结论TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞α-actin和FN的表达增加可能与烧伤瘢痕挛缩有关.     

应用成纤维细胞胶原网格体外三维培养模型观察重组核心蛋白多糖固相态时对转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的应答

目的:模拟体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1接触方式,研究核心蛋白多糖在固相抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用。方法:实验于2005-01/09在广州市创伤研究所完成。①实验成纤维细胞的组织来源:取材于广州市红十字会医院,患者自愿,正常皮肤为包皮。取新鲜包皮,修除表皮和皮下组织,加入含体积分数0.02的胎牛血清的DMEM培养,实验用第4～8代细胞。②采用醋酸法从鼠尾腱中提取I型胶原,使用浓度为2g/L,网格胶原终浓度为1g/L,成纤维细胞密度为1×109L-1。将胶原细胞混悬液按2mL/皿均匀加入直径35mm的培养皿内,37℃培养10min,混悬液便形成凝胶即成纤维细胞胶原网格,再加入相应的培养液。分为4组:对照组、核心蛋白多糖组、转化生长因子β1组、转化生长因子β1 核心蛋白多糖组。③观察成纤维细胞胶原网格的收缩,Westernblot法检测成纤维细胞胶原网格中成纤维细胞纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达。结果:①成纤维细胞胶原网格收缩的变化:对照组成纤维细胞胶原网格培养12h,收缩到起始面积的(81.2±4.9)%,12～24h收缩加剧,在24h收缩到起始面积的(47.4±4.7)%,以后收缩减慢,在48h收缩到起始面积的(37.3±3.6)%,72h收缩到起始面积的(29.6±3.6)%,96h收缩到起始面积的(28.7±2.8)%,以后不再收缩;核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在12,24,48,72,96h均高于对照组(P<0.05);转化生长因子β1组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均低于对照组(P<0.01);转化生长因子β1 核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均高于转化生长因子β1组(P<0.05),与对照组比较无显著差异(P>0.05)。②成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1391.61±126.27,525.97±60.10),与对照组(1474.52±133.84,569.41±62.55)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(2909.77±264.04,2725.46±150.54)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1775.25±161.09,926.34±51.16)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。③成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.19±0.05,0.07±0.02),与对照组(0.21±0.06,0.08±0.03)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.86±0.15,0.36±0.10)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.34±0.09,0.13±0.04)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:重组核心蛋白多糖融入胶原凝胶,能显著抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用,表明在体内核心蛋白多糖具有拮抗转化生长因子β1的作用。     

VEGF、bFGF浓度梯度对猪血管内皮细胞、成纤维细胞增殖移行的影响

[目的]探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度梯度对于猪体外血管内皮细胞、成纤维细胞增殖移行的影响.[方法]以不同浓度VEGF、bFGF刺激猪血管内皮细胞、成纤维细胞,筛选出在各时间点细胞增殖及移行活力均有显著差异的三个浓度构成浓度梯度.以胶原膜片加载VEGF、bFGF,以MTT法和计算细胞迁移距离法比较不同时间点浓度梯度组与单一浓度组细胞增殖移行活力的差异.[结果]VEGF浓度梯度组在24 h、48 h、72 h时间点,VEGF浓度梯度组OD值均显著小于对照组25 ng/mL和100 ng/mL(P<0.05);VEGF浓度梯度组6 h、12 h、24 h迁移距离明显大于对照组5 ng/mL组、25 ng/mL(P<0.05),但6 h、12h、24 h与对照组100 ng/mL比较无显著性差异(P>0.05),在12 h小于对照组100 ng/mL(P<0.05).在不同时间点bFGF浓度梯度组OD值与对照组10 ng/mL OD值比较无显著性差异(P>0.05);但均小于对照组50 ng/mL和100 ng/mL(P<0.05);bFGF浓度梯度组在不同时间点的迁移距离均显著大于对照组10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL,其差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]VEGF、bFGF浓度梯度对于血管内皮细胞、成纤维细胞的迁移活力促进作用高于单一浓度,但因受生长因子浓度影响,而对于血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖活力较单一低浓度无明显促进作用.     

骨形成蛋白-7对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

目的探讨骨形成蛋白-7(BMP-7)对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响。方法晚期糖基化终产物诱导发生上皮-间叶转化的体外培养大鼠腹膜间皮细胞,分别经含5 ng/mL及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基和含10 ng/mL BMP-7及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基培养48 h,以含80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基为对照,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果 BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGFmRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 BMP-7能上调上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin表达和下调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达,BMP-7能逆转晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

粉防己碱对转化生长因子-β1诱导的人近端小管上皮细胞转分化的干预作用及机制

目的探讨粉防己碱(tetrandrine,Tet)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的拮抗效应及其机制。方法体外培养的HK-2随机分为正常对照组、Tet组(100ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)组和TGF-β1(5ng/ml)+Tet(100ng/ml)组。Westernblot法检测细胞中TβRI蛋白、SnoN蛋白水平、Smad7蛋白水平和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法观察细胞中TβRI mRNA、Smad7 mRNA、SnoN mRNA表达的改变。免疫荧光检测间充质细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果 Tet能抑制TGF-β1诱导α-SMA的表达,显著上调SnoN mRNA和蛋白的表达(P<0.01);Tet对TβRI表达、Smad2/3的磷酸化及Smad7的表达没有影响。结论 Tet能抑制人近端小管上皮细胞转分化,其机制与Tet上调SnoN表达有关。     

Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的:研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法:利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验,观察组织病理变化;分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞,观察其胶原收缩能力的变化。结果:Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快;成纤维细胞胶原收缩试验中,Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞,而在无血清培养条件下,有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论:SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力,以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。     

A型肉毒毒素对增生性瘢痕JNK信号通路和成纤维细胞相关蛋白表达的影响

目的 增生性瘢痕是一种真皮纤维增生性疾病。A型肉毒毒素具有预防增生性瘢痕形成的作用,但其抗皮肤纤维化的作用及其机制尚不清楚。本研究分析A型肉毒毒素(BTXA)对增生性瘢痕(HS)JNK信号通路和成纤维细胞相关蛋白表达的影响。方法 本研究采用0、1、2、4U/ml BTXA对人瘢痕成纤维细胞进行干预,通过CCK8划痕法、荧光定量PCR和western印迹法检测不同浓度BTXA对HS成纤维细胞增殖、迁移、细胞凋亡和蛋白表达的变化。并对比BTXA干预前后转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、磷酸化氨基末端激酶(p-JNK)等成纤维细胞相关蛋白表达的变化。结果 与无BTXA干预相比,1、2、4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞增殖能力较低(P<0.05);与无BTXA干预相比,1、2、4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞凋亡率增高(P<0.05);与BTXA干预前相比,BTXA干预后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低(P<0.05);与JNK选...     

TGF-β2对豚鼠实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞MMP-2表达的影响

目的明确转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)对豚鼠镜片诱导型近视眼后极部巩膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMPs)表达的影响。方法选择2周龄已脱离母乳喂养的豚鼠12只,随机选取12只中各一眼用镜片诱导法制备近视动物模型(实验组),对侧眼不予任何处理(自身对照组)。30 d后采用组织块培养法培养豚鼠后极部巩膜成纤维细胞,并传2代。将每只眼(两组24只眼)培养出的细胞分别分为空白对照组、1 ng/mlTGF-β2组、10 ng/ml TGF-β2组、100 ng/ml TGF-β2组,利用实时荧光定量聚合酶链反应、western-blot蛋白印迹法对各组细胞MMP-2、MMP-2mRNA进行定量分析。结果经30 d镜片诱导,实验组诱导出(-6.70±1.93)D的相对近视,眼轴相对延长(1.53±0.31)mm,实验前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组中空白对照组与自身对照组中空白对照组比较,MMP-2、MMP-2mRNA表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β2浓度为10 ng/ml时实验组和自身对照组细胞MMP-2、MMP-2mRNA的表达量最高,与本组其他浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论凹透镜诱导可引起豚鼠明显轴性近视,TGF-β2能有效刺激MMP-2的表达。     

转化生长因子β1介导的Smad信号通路对人腹膜间皮细胞外基质的调控

目的探讨TGF-β1介导的Smad信号通路对人腹膜间皮细胞(HPMCs)细胞外基质(ECM)的调控机制.方法原代培养的第三代HPMCs分成对照组与5ng/mlTGF-β1刺激组,采用免疫组织化学染色和Western印迹法观察细胞内磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表达以及在细胞内的迁移,Western印迹、ELISA和RT-PCR法观察Smad7、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(COL1)的mRNA及蛋白表达.结果①对照组细胞内几乎不表达p-Smad22/3,在刺激后15 min蛋白表达增加,主要分散在细胞质中,1h达高峰,主要集中在细胞核及周边,2h明显回落,又分散至细胞质中;②刺激组细胞内Smad7、CTGF、α-SMA和COL1的蛋白表达与对照组比均增加,其中Smad7、CTGF和α-SMA在48h最明显,COL1呈时间依从性;刺激组上清液PAI-1的蛋白含量与对照组比均增加,其中24h最高,FN呈时间依从性;刺激组Smad7的mRNA表达与对照组比呈时间依从性增加,CTGF、α-SMA、PM-1、FN和COL1均增加,其中CTGF和α-SMA在48h最高,PAI-1在24h最高,FN和COL1呈时间依从性.结论TGF-β1能特异性激活HPMCs内Smad信号通路,并可通过诱导该通路下游靶基因Smad7、CTGF、α-SMA、PAI-1、FN和COL1的转录与表达参与对ECM的调控.     

转化生长因子-β3对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

背景哺乳类动物有3种TGF-β异构体即TGF-β1,β2,β3,这3种异构体各自具有独特而不同的生物学作用,TGF-β1是明显的促瘢痕形成因子,而TGF-β3可减少TGF-β1,β2的产生,从而减少细胞外基质(ECM)合成,因此,TGF-β3有可能是人体内天然的抗瘢痕形成因子.目的通过外源性TGF-β3对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)生长增殖及Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响,了解其生物学行为,为临床治疗提供理论依据.设计随机对照实验研究.地点和对象汕头大学医学院第二附属医院整形烧伤外科完成,对象为新鲜无菌增生性瘢痕组织,来源于本科收治及门诊手术的增生性瘢痕患者6例,男3例,女3例;年龄5～45岁.干预6例增生性瘢痕成纤维细胞体外培养,分为4组,实验组又分为5,10,50 mg/L组分别加TGF-β3 5,10,及50 mg/L,对照组加入FBM1.5 mL,采用MTT比色法测定TGF-β3对HSFB增殖活性的影响,3H-脯氨酸掺人法测定其胶原合成,免疫组化检测Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达情况.主要观察指标TGF-β3对HSFB体外增殖,HSFB Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响,TGF-β3作用后HSFB胶原合成情况.结果转化生长因子β3可抑制HSFB细胞增殖,作用120 h后实验组细胞密度分别为(6.34±0 51),(6.01±0.38),(5.24±0.65)×105/瓶,明显低于对照组(10.69±0.76)x105/瓶(F=102.432～163 024,P＜0.01);转化生长因子β3可抑制胶原蛋白合成,实验组(10,50mg/L组)脯氨酸含量分别为(164.01±70.27),(151 02±49 85)min-1明显低于对照组9231.56±67.83)min-1(q=32.124,31.021,P＜0.01);下调TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达;而对Ⅲ型胶原影响较小.结论TGF-β3可抑制HSFB细胞增殖,下调TGF-β1蛋白表达,减少胶原合成,显示其具有抗组织纤维化的作用,具有临床应用价值.     

几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌细胞因子的影响

目的观察几丁糖对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),白细胞介素8(IL-8)的影响,探讨几丁糖对异常瘢痕成纤维细胞生物学活性的作用。方法以瘢痕疙瘩及增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象,正常皮肤成纤维细胞为对照,用组织块法进行不同标本成纤维细胞体外培养。用定量酶联检测试剂盒测定TGF-β1、bFGF、IL-8等。结果几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF、IL-8的能力作用不同。不同含量几丁糖作用后,TGF-β1、bFGF分泌量逐渐减少,IL-8分泌量逐渐增加。无几丁糖和相同含量下,TGF-β1、bFGF分泌量,瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组无显著差别(t=0.7,Р>0.05),两组与正常皮肤组差别显著(t=2.8,Р<0.05),3组的减少率无显著差异(t=0.5,Р>0.05)。IL-8的分泌量,无几丁糖时3组无显著差异(t=1.2,Р>0.05);不同含量几丁糖作用下,IL-8分泌量逐渐增加率无显著差异(t=0.8,Р>0.05)。结论几丁糖可抑制瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF,促进其分泌IL-8,进而调节成纤维细胞的生长、增殖、合成及分泌胶原的功能。     

高糖刺激大鼠肾间质成纤维细胞TGF-β、CTGF及α-SMA作用研究

目的探讨高糖对大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法将处于对数生长期的大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f用无血清高糖DMEM培养12h、24h及48h,同时设空白对照组,用Western Blot及实时定量RT-PCR法检测并分析各组细胞TGF-β、CTGF及α-SMA表达情况。结果高糖DMEM作用于NRK49f12h即可见TGF-β、CTGF蛋白表达均有增加趋势,与正常对照组比较,高糖刺激24h及48h组TGF-β相对表达量均明显增加,差异有统计学意义(P0.05),且与高糖12h组比较,二者相对表达量变化明显增加(P0.05);高糖DMEM作用于NRK49f12h即可见TGF-β、CTGF mRNA表达均增加,至高糖刺激培养细胞24h及48h时,二者相对表达量均明显高于对照组及高糖培养12h组,差异均有统计学意义(P0.05);高糖DMEM作用于NRK49f24h时可见α-SMA表达条带,至高糖DMEM培养48h时,α-SMA相对表达量最高。结论高糖可刺激体外培养的肾间质成纤维细胞表达TGF-β和CTGF的转录和翻译,并可刺激其表达α-SMA。