Colti病毒的分离及其生物学性状

１９９４年夏秋季从北京郊区采集的蚊子中分离到两株Ｃｏｌｔｉ病毒（北京９５－７０和北京９５－７５）。病毒在Ｃ６／３６细胞引起明显的细胞病变，但在ＢＨＫ－２１和Ｖｅｒｏ细胞未见明显病变。对５’－碘脱氧尿苷和乙醚抵抗，表明为无包膜ＲＮＡ病毒；对酸敏感，在ｐＨ３．０条件下病毒滴度降低３．５～４．５个对数以上。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示病毒基因组为１２节段ＲＮＡ，两株病毒的电泳带型完全相同，与１９９１年分离的Ｃｏｌｔｉ病毒ＴＲＴ２株带型基本一致，皆为６－６带型，但仔细比较至少有８条带的迁移率存在着细微差别。组织培养交叉中和试验表明，新分离株与ＴＲＴ２株的抗原性未见明显差异，可能属同一血清型。病毒在Ｃ６／３６细胞繁殖可能造成持续感染。     

引起人类脑炎的新双链RNA病毒

全世界已经报道的病毒有5400多种，其中双链RNA病毒除了双RNA病毒科外，绝大多数都存在于呼肠孤病毒科。2005年国际病毒分类委员会（International Committee for Taxonomy ofvirus，ICTV）第八次分类报告中正式公布在呼肠孤病毒科中增加一个新属，其英文名称为Seadomavirus。新建立的属目前包括三种病毒，版纳病毒（Banna virus，BAV）Kadipiro病毒（KDV）和辽宁病毒（Liaoning virus，LNV），其中版纳病毒为我国科学家首次在云南省西双版纳地区分离的病毒，辽宁病毒是首次在我国辽宁分离到的病毒。该属代表病毒为版纳病毒，这是国际间首次以我国科学家分离的病毒建立病毒属，同时也是首次以我国分离到病毒的地名命名病毒。大量资料显示，新建立病毒属内的病毒可以引起人畜发热、感冒样症状等，特别是我国曾从脑炎病例脑脊液标本中分离到版纳病毒，并用中和试验证实脑炎患者急性期和恢复期双份血清中抗体存在4倍差异，表明该病毒是引起病毒性脑炎的重要病原。该属病毒引起国内外病毒学家和临床医生的极大关注。本文将就该病毒属的命名和分类史、病毒基本生物学特征，特别是病毒致病性等方面的研究进展做一介绍。     

Coltivirus新成员的分离和鉴定

１９９１年，在甘肃和北京地区采集蚊子，从中分离到１０株病毒，该类病毒在Ｃ６／３６，ＢＨＫ－２１及Ｖｅｒｏ细胞上可出现病变，使乳鼠发病、致死，抵抗乙醚和５－溴脱氧尿苷，电镜观察为球形、无包膜，直径约６２．７±３．１３ｎｍ。ＰＡＧＥ示该类病毒ＲＮＡ为１２节段，分为４个不同的电泳带型，均与云南分离株不同。交互中和试验和交互补体结合试验表明，中国分离株之间抗原性有变异。中国分离株与Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ属已知成员科罗拉多蜱热病毒、加利福尼亚分离株Ｓ６－１４－０３及德国分离株Ｅｙａｃｈ有血清学交叉反应（１：４～１：８），但血清型明显不同，因而，中国分离株当属Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ属的新的成员。     

从海南岛蚊和蜱分离出28株甲病毒属病毒

１９８３～１９８８年在海南岛从自然界捕蚊和蜱分离出非登革病毒和非日本脑炎病毒的２８株病毒，其中２７株是从不同种的蚊分离出的，１株是从蜱分离出的。９０年代初期在美国疾病控制中心的媒介传播的病毒性疾病分部，用全套国际标准化的抗节肢动物携带的病毒的抗体，对这２８株病毒进行了病毒科的鉴别和病毒属的鉴定，结果证明这２８株病毒都属于披膜病毒科的甲病毒属。     

从烟台地区蚊虫分离到披膜甲属虫媒病毒

目的　从烟台地区自然界捕捉的蚊虫中分离虫媒病毒。方法　对分离的 15株虫媒病毒中的 3株进行理化特性分析 ,电镜检查以及特异性免疫反应观察。结果　多次实验均显示该病毒对乙醚敏感 ,抵抗 5′ 碘脱氧尿苷 (5′ Idu) ,能在白蚊伊蚊C6 / 36传代细胞上生长繁殖 ,并能引起典型细胞病变 ,乳鼠脑内接种不引起规律发病和死亡。电镜观察 ,可见大小相同的球形病毒颗粒 ,毒粒直径约 (5 5± 2 3)nm。该病毒与乙脑病毒和布尼亚病毒科的组特异性免疫腹水均不反应 ,而与披膜病毒科甲属特异性免疫腹水有交叉反应。结论　本次分离到的病毒为披膜甲属虫媒病毒。     

云南省西部边境新分离蚊媒病毒分子生物学特征分析

目的 分析云南中缅边境地区新分离蚊媒病毒的分子生物学特征,以分析其遗传进化特征.方法 2010年1-12月在云南省德宏州芒市和瑞丽市监测点每月一次用诱蚊器采集蚊虫,用BHK-21和C6/36细胞分离病毒,阳性分离物用RT-PCR法进行鉴定及序列测定和分析.结果 从采获的7属42种69 209只蚊虫中分离到13株流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),4株盖塔病毒(Getah virus,GETV),1株西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV),7株淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens densovirus,CppDNV).JEV E基因进化分析证实,新分离的13株JEV均属基因Ⅰ型,与云南其它地区和邻近省份流行株亲缘关系较近,且抗原和毒力位点未发生明显改变.4株GETVE2基因与云南其它地区分离株同源性高,亲缘关系近.新分离环状病毒的VP1基因与TIBOV亲缘关系最近,而与云南环状病毒(Yunnan orbivirus)存在明显差异.7株CppDNV的NS1基因与以往云南及其他省区流行株具有较高的同源性和亲缘关系.结论 首次证实该地区存在基因Ⅰ型JEV、GETV、TIBOV和CppDNV流行,这些流行株均具有较为稳定的遗传特征和地域特征.     

我国首次分离到基因Ⅰ型乙型脑炎病毒

目的　对新分离乙型脑炎病毒鉴定 ,了解病毒E基因区段的氨基酸序列特征及基因分型。方法　 2 0 0 1年在上海市采集蚊虫标本 ,用组织培养的方法分离到 7株病毒。进行病毒一般生物学鉴定 ,对病毒PrM和E基因区段约 2 0 0 0nt进行了扩增、克隆、测序。应用ClustalX软件做碱基配对和比较分析 ,种系发生采用PHYLIP软件包分析。结果　 7株病毒可以引起BHK 2 1细胞规律病变 ,病变时间为 6 0h。乳鼠脑内接种病毒后 72h死亡。所有新分离病毒与标准乙型脑炎病毒抗体阳性反应。用病毒PrM区段 (4 5 6～ 6 95位核苷酸 )进行的基因分型分析 ,新分离的 7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒。以减毒活疫苗株SA14 14 2为标准 ,对 7株病毒的E基因区段进行分析 ,7株病毒之间核苷酸同源性在 97.7%以上 ,氨基酸同源性在 99.2 %以上 ;7株病毒与疫苗株SA14 14 2核苷酸差异在 12 .2 %左右 ,氨基酸差异在 2 .8%～ 3.2 %之间 ,共有 14个共同的氨基酸位点差异。结论　 2 0 0 1年在上海采集的蚊虫中新分离的 7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒 ,为我国的首次报道     

从辽宁省再次分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 了解2007年在辽宁省分离的乙型脑炎病毒基因型别及其病毒E基因分子特征.方法2006年8月在辽宁省东港市采集蚊虫标本,利用组织培养细胞进行病毒分离,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果从采集的30批,共1500只三带喙库蚊标本中分离到2株病毒,命名为LNDG07-02、LNDG07-16,经鉴定均为基因1型乙脑病毒.病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列与乙脑减毒活疫苗株(SA14-14-2株)的同源性分别为87.8%～88.0%和97.2%,新分离病毒E基因区段与疫苗株存在11处氨基酸位点差异,与2002年在辽宁省分离的乙脑病毒相比,未发现氨基酸位点变异.结论自2002年以来在东港市再次分离到基因1型乙脑病毒,与2002年在辽宁分离的基因1型乙脑病毒相比E基因区段氨基酸未发生变异.基因1型乙脑病毒在辽宁省东港市持续存在.     

中国人感染H5N1亚型高致病性禽流感病例病毒分离培养探讨

目的 分析中国大陆人感染H5N1高致病性禽流感病例标本采集和病毒分离培养之间的关系.方法 对2005年10月至2009年3月中国大陆人感染H5N1高致病性禽流感病例标本进行病毒分离培养.结果 标本采集时间主要集中在发病后的0～14 d,其中0～7 d采样的标本阳性率分布相对集中,病毒分离的效果要更加显著;标本采集类型主要为呼吸道标本,其中下呼吸道标本的病毒分离阳性率分布较集中,病毒分离效果也更明显.结论 人禽流感病例标本采集时间及标本的采集类型对病毒分离有一定的影响,应在发病的急性期侧重于采集下呼吸道标本,这样利于提高病毒分离的阳性率.     

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征,以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列,并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示,从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化,从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。     

秦皇岛市各型肝炎病毒感染的血清流行病学研究

对１９９２年至１９９５年在秦皇岛市各医院住院的３２６例肝病患者进行各型肝炎病毒感染的血流流行病学分析，表明在慢性肝炎、肝硬化和原当性肝细胞肝癌中未检出甲型肝炎病毒抗体、乙型肝炎病毒在ＣＨ、ＬＣ和ＨＣＣ的感染率分别为７７．７８％，８４．２１％和９４．２９％，而在急性肝炎中的感染率为２１．５９％。     

Characterization of Culex Flavivirus (Flaviviridae) strains isolated from mosquitoes in the United States and Trinidad

Recent reports indicate that flaviviruses similar to the cell fusing agent virus (CFAV) naturally infect a wide variety of mosquito species. These newly recognized insect-specific viruses comprise a distinct CFAV complex within the genus Flavivirus. Here, we describe the isolation and characterization of nine strains of Culex flavivirus (Cx FV), a member of the CFAV complex, from mosquitoes collected in the United States (East Texas) and Trinidad. Phylogenetic analyses of the envelope protein gene sequences of these nine mosquito isolates with those of other CFAV complex flaviviruses in GenBank indicate that the U.S. isolates group with CxFV isolates from Asia (Japan and Indonesia), while the Trinidad isolates are more similar to CxFV isolates from Central America. A discussion follows on the possible biological significance of the CFAV complex flaviviruses.     

Internally deleted WNV genomes isolated from exotic birds in New Mexico: function in cells, mosquitoes, and mice

Most RNA viruses exist in their hosts as a heterogeneous population of related variants. Due to error prone replication, mutants are constantly generated which may differ in individual fitness from the population as a whole. Here we characterize three WNV isolates that contain, along with full-length genomes, mutants with large internal deletions to structural and nonstructural protein-coding regions. The isolates were all obtained from lorikeets that died from WNV at the Rio Grande Zoo in Albuquerque, NM between 2005 and 2007. The deletions are approximately 2 kb, in frame, and result in the elimination of the complete envelope, and portions of the prM and NS-1 proteins. In Vero cell culture, these internally deleted WNV genomes function as defective interfering particles, reducing the production of full-length virus when introduced at high multiplicities of infection. In mosquitoes, the shortened WNV genomes reduced infection and dissemination rates, and virus titers overall, and were not detected in legs or salivary secretions at 14 or 21 days post-infection. In mice, inoculation with internally deleted genomes did not attenuate pathogenesis relative to full-length or infectious clone derived virus, and shortened genomes were not detected in mice at the time of death. These observations provide evidence that large deletions may occur within flavivirus populations more frequently than has generally been appreciated and suggest that they impact population phenotype minimally. Additionally, our findings suggest that highly similar mutants may frequently occur in particular vertebrate hosts.     

Enrichment of measles virus-like RNA in the nucleocapsid fraction isolated from subacute sclerosing panencephalitis brains

A procedure has been developed which facilitates the detection of measles virus RNA sequences in human brains. The procedure involves isolating subviral components (nucleocapsids) from brain tissues prior to RNA purification, followed by hybridization of these RNAs to cDNA synthesized from measles virus 50 S RNA template. Using these techniques we were able to obtain an RNA fraction which was manyfold enriched in measles virus-specific RNA, relative to unfractionated subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) brain RNAs. 70–100% of the measles virus-specific RNA present in these SSPE brain samples were recovered in this enriched fraction.     

促癌剂协同下Epstein-Barr病毒体内外感染引起人胚鼻咽上皮的形态学改变

目的探讨在促癌剂协同下Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）对人胚鼻咽上皮的感染和转化能力。方法体外培养的人胚鼻咽上皮分别接受ＥＢＶ、ＥＢＶ＋佛波酯（ＴＰＡ）或ＴＰＡ处理，不同时间测量细胞生长晕大小，收集细胞，涂片，ＨＥ染色作形态测量；移植了人胚鼻咽组织的裸小鼠分别接受多次ＥＢＶ、ＥＢＶ＋ＴＰＡ皮下注射，处死动物后对移植物作常规病理切片观察。结果体外培养的人胚鼻咽上皮在ＥＢＶ转染后（单用ＥＢＶ或在ＴＰＡ协同下），生长能力增加，核浆比增大；在体内，ＥＢＶ感染（单用ＥＢＶ或在ＴＰＡ协同下）可引起移植于裸小鼠的人胚鼻咽组织癌变（原位癌与早期浸润癌各１例）。在体外，单独使用ＴＰＡ没有诱癌作用，但似能增加ＥＢＶ的感染率，尤其在早期；在体内，在ＴＰＡ协同下，ＥＢＶ能诱发早期浸润癌。结论提示ＥＢＶ在体外能使人胚鼻咽上皮细胞出现恶性转化倾向，及引起移植于裸小鼠的人胚鼻咽组织癌变，ＴＰＡ能促进ＥＢＶ感染和致癌作用。     

我国急性散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

用逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）自深圳、长春、杭州等地４１份急性散发性戊型肝炎病人血清中获得２８株ＨＥＶｃＤＮＡ，对其中３株ＨＥＶｃＤＮＡ的ＯＲＦ２基因片段，用荧光法直接测定其核苷酸序列，并与戊型肝炎病毒墨西哥株（Ｍ）、缅甸株（Ｂ）和新疆流行株（ＣＨ１·１）进行了比较，结果该３株散发性ＨＥＶ与Ｍ株的核苷酸序列同源性分别为８０．２％、７９．９％和７９．４％；与Ｂ流行株的同源性为９５．５％、９３．９％和９５．１％；与散发株的同源性为９３．４％、９２．３％和９３．８％；与ＣＨ１·１的同源性为９７．０％、９６．５％和９５．９；表明该３株散发性ＨＥＶ与ＨＥＶ（Ｂ）和ＣＨ１·１的核酸序列同源性较高，可能属同一亚型。     

在内蒙古蚊虫中分离到版纳病毒

目的 鉴定内蒙古通辽市分离的虫媒病毒.方法 使用血清学及分子生物学方法鉴定内蒙古蚊虫标本分离的病毒,对毒株的部分核苷酸序列进行测定,应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA软件完成病毒进化分析,DNAStar软件包中的MegAlign完成核苷酸和氨基酸同源性分析.结果 在内蒙古通辽市采集凶小库蚊标本分离的病毒经过血清学和分子生物学实验鉴定为版纳病毒(Banna virus,BAV),与版纳病毒部分中国分离株位于同一进化分支中,病毒第12片段核苷酸同源性为89.6%～98.4%,氨基酸同源性为90.4%～98.6%.结论 在内蒙古凶小库蚊标本中分离到版纳病毒.