骨保护素的克隆及对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的:克隆人骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)基因并构建其重组腺病毒,观察其对BMSCs分化的影响.方法:RT-PCR方法从人肝克隆OPG基因全长cDNA,利用穿梭质粒将OPG基因重组获得复制缺陷型重组腺病毒AdOPG;分离培养兔骨髓间充质干细胞,使用AdOPG感染兔BMSCs,以RT-PCR及Western Blot的方法鉴定BMSCs对OPG的表达.比色测定和细胞碱性磷酸酶染色法观察AdOPG感染BMSCs后5 d时碱性磷酸酶(ALP)的表达.结果:克隆获得人OPG基因,测序与Gene bank一致,构建的重组腺病毒AdOPG滴度达109 efu/ml,AdOPG感染BMSCs 5 d后ALP活性值为(21 024±507)IU,AdGFP对照组为(3 079±89)IU,空白对照组为(2 156±78)IU.结论:骨保护素有利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化.     

生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞的实验研究

目的研究生长分化因子5(Growth and differentiation[actor 5,GDF5)在诱导骨髓间充质干细胞(bonemarrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成软骨分化中的作用。方法通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,利用腺病毒载体将GDF5基因导入骨髓间充质干细胞,通过Safranin-O染色和甲苯胺蓝染色检测硫酸糖胺聚糖和蛋白聚糖、RT-PCR和免疫化学染色检测软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白的表达,探索GDF5腺病毒对BMSCs成软骨分化的诱导作用。结果 GDF5腺病毒感染的BMSCs细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量显著增加,软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白表达升高。结论本研究结果表明,GDF5能够显著促进脂肪间充质干细胞的成软骨分化。     

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的：构建LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法：RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白－２（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,并构建pIRES2-EGFP-LMP－1及pIRES2-EGFP-BMP－2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP－1、pIRES2-EGFP-BMP－2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果：pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论：LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

hBcl-2和hVEGF165双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的 基因的表达及表达产物的生物学效应.方法 贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的 基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双...     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

腺病毒介导p55γ基因N末端的过表达对胃癌细胞增殖的影响

目的：通过腺病毒介导,研究磷脂酰肌醇3-激酶p55γ调节亚基N末端24个氨基酸的过表达对胃癌MGC803细胞生长增殖的影响。方法：在HEK293细胞中扩增重组腺病毒Ad—N24-GFP以及空载体病毒Ad—GFP,并进行病毒滴度以及腺病毒对胃癌细胞感染率的测定,免疫印迹方法鉴定重组腺病毒感染MGC803细胞后融合蛋白N24-GFP的表达。通过细胞生长曲线和克隆形成实验观察Ad—N24-GFP对细胞增殖的影响。结果：重组腺病毒经过感染HEK293细胞后大量扩增,病毒滴度测定为1．0×10^10pfu／ml,重组腺病毒对MGC803细胞的感染率在感染复数（MOI）为100时最强。与空载体细胞相比较,N24-GFP的高表达明显抑制MGC803细胞的生长,且抑制程度随病毒感染复数的增加呈逐渐增强的趋势;感染Ad—N24-GFP组细胞的克隆形成率[（28．30±3．25）％]明显低于对照组细胞[（42．16±2．84）％,P〈0．05]。结论：腺病毒介导N24p55γ基因的过表达能抑制胃癌细胞MGC803的增殖,其在胃癌基因治疗上可能具有潜在的应用前景。     

携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

目的：构建携带人白细胞介素10（hIL-10）和人肝细胞生长因子（hHGF）双基因的重组腺病毒载体。方法：分别以pDC316-hIL10-EGFP和pCDNA3-hHGF重组质粒为模板,PCR扩增获得hIL-10和hHGF基因片段,与pIRES连接成为hIL10-IRES—hHGF,测序正确后酶切,与pDC315连接,获得穿梭质粒pDC315-hIL10-IRES—hHGF,与腺病毒包装系统转染293细胞,包装产生重组腺病毒hIL10—hHGF,PCR鉴定后,扩增病毒,并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL-7402和WRL-68细胞,ELISA法检测上清液中hIL—10和hHGF的含量。结果：成功构建了重组腺病毒hIL10—hHGF,扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×10^9pfu／ml,转染BEL-7402和WRL-68细胞72h后,表达hIL-10的量分别为（6271．7±5．2）pg/ml和（350．6±12．4）pg／ml,表达hHGF的量分别为（20827．1±345．5）pg／ml和（201．6±10．1）pg／ml。结论：本实验为进一步研究Ad—hIL10—hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

国产重组人生长激素治疗特发性生长激素缺乏症的疗效分析

目的：观察国产重组人生长激素（rhGH）治疗特发性生长激素缺乏症（IGHD）的临床疗效和安全性。方法：应rhGH治疗IGHD24例，按剂量0．1IU／kg，1次／d，每晚睡前皮下注射，疗程6个月。观察用药后生长速度，血碱性磷酸酶，血甲状腺激素T3、T4、TSH等生化指标的变化，跟踪随访。结果：治疗后IGHD患者的生长速度由（2．8±0．8）cm／年增至（12．3±2．4）cm／年（治疗3个月时）、（10．4±2．8）cm／年（治疗6个月时），无明显副作用。结论：国产rhGH治疗IGHD疗效显著，安全可靠。     

腺病毒介导的热休克蛋白70表达对神经元氧化应激损伤的保护作用

目的探讨重组腺病毒介导的HSP70表达对过氧化氢（H2O2）诱导的神经元和胶质细胞损伤的保护作用。方法用携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70感染体外培养的神经元和胶质细胞,RT-PCR、West-ern blotting检测靶细胞中外源性HSP70的表达。vAd-HSP70感染组、vAd-GFP感染组和未感染组细胞经0.5 mmol/L的H2O2处理后,MTT检测细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞培养上清液中LDH活力,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果vAd-HSP70感染组的细胞可检测到外源性HSP70基因表达。H2O2处理后,vAd-HSP70感染组细胞活力较其他组明显增强（P〈0.01）,vAd-HSP70感染组、vAd-GFP感染组、未感染组细胞培养上清液中LDH活力分别为（976±106）、（1 332±197）、（1 380±121）,差异有统计学意义（P〈0.01）。电镜结果显示,vAd-HSP70感染组细胞膜较vAd-GFP感染组和未感染组完整清晰,无明显线粒体肿胀及细胞核溶解等不可逆损伤情况。结论腺病毒介导的外源性HSP70表达可保护神经元和胶质细胞抵抗H2O2损伤,具有明确的细胞保护作用。     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响

目的：观察人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7基因表达腺病毒AdB7V，体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达，通过对感染细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。结果：hMSC经AdB7V感染后72h可观察到GFP表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7在hMSC中表达，感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。结论：外源性的人BMP-7基因可在hMSC中表达并诱导其向成骨细胞分化。     

GDNF基因修饰对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的影响

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的潜能。方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并鉴定,分别用GDNF基因重组腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-GDNF)和空质粒腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV)感染BMSCs建立BMSCs/GDNF和BMSCs/GFP两种细胞。两种细胞用DMSO/β-ME/ATRA进行诱导分化,观察细胞形态变化,采用Hoechst染色和免疫荧光细胞化学染色检测细胞凋亡和分化情况。结果:与BMSCs/GFP组相比,BMSCs/GDNF组的BMSCs经诱导后细胞凋亡率降低,NF-200阳性细胞率上升,但GFAP阳性细胞率无明显变化。结论:GDNF基因修饰有利于BMSCs抗细胞凋亡和分化为神经元样细胞,这为进一步研究GDNF基因修饰的BMSCs应用于中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础。     

神经营养因子-3通过Wnt通路促进人骨髓间充质干细胞生长和成骨分化的研究

目的  阐明神经营养因子-3（NT-3）促进人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力,并分析Wnt通路的作用机制。方法  正常培养的人骨髓间充质干细胞为对照组;NT-3刺激的人骨髓间充质干细胞为NT-3组;加入ICG-001作用30 min后,用NT-3刺激者为Wnt抑制剂组,每组进行成骨诱导实验。利用噻唑蓝细胞增殖、酶联免疫吸附试验、Western blot检测、茜素红染色等实验分别检测各组人骨髓间充质干细胞增殖、细胞凋亡、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-1（BMP-1）等蛋白表达及钙结节形成能力。结果  与对照组比较,NT-3组间充质干细胞（MSC）增殖吸光度值增高（P <0.01）;NT-3组碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达或茜素红染色效果均高于对照组（P <0.01）;与NT-3组比较,Wnt抑制剂组MSC增殖吸光度值降低（P <0.01）;而Wnt抑制剂组的碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达均低于NT-3组（P <0.01）。结论  NT-3通过Wnt通路,促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

改良腺病毒AdF35-eGFP转染人 及大鼠骨髓间充质干细胞的效率对比研究

目的：比较改良腺病毒AdF35-增强绿荧光蛋白（eGFP）转染人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）和大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs, rBMSCs)的效率。方法：分别从人体、大鼠骨髓中分离出BMSCs,成骨、成脂诱导培养以鉴定BMSCs。构建含eGFP的AdF35重组腺病毒载体AdF35-eGFP,以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别转染BMSCs后,MTT检测AdF35-eGFP对2种BMSCs的毒性作用,荧光显微镜观察eGFP的表达,流式细胞仪检测转染效率,实时定量PCR检测2种BMSCs表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)和CD46 mRNA的水平。结果：hBMSCs和rBMSCs从骨髓中分离出来后,分别成功诱导分化成骨和成脂。当MOI为1 000 PFU/mL时,AdF35-EGFP对2种BMSCs的活性均有明显抑制作用（P<0.001）。AdF35-eGFP感染hBMSCs 48 h后,荧光显微镜下可见发强烈绿色荧光的细胞,流式细胞仪检测其转染效率可达(84.8±7.1)％;Ad5-eGFP感染rBMSCs后,荧光显微镜下仅见少量发绿色荧光的细胞,48 h转染效率为(3.1±1.1)％。hBMSCs高表达CD46 mRNA,低表达CAR mRNA;而rBMSCs则高表达CAR mRNA,低表达CD46 mRNA,2种基因的表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：AdF35可作为理想载体携带目的基因转染hBMSCs,但不适合作为转染rBMSCs的载体。     

含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

hBMP-7基因瞬时转染绝经后骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的表达及对其生物学活性的影响

目的观察hBMP-7基因瞬时转染对去卵巢（OVX）大鼠的骨髓基质细胞（BMSCs）生物学特性的影响。方法通过去除双侧卵巢构建SD大鼠绝经后骨质疏松模型后,全骨髓法培养大鼠BMSCs,通过重组腺病毒将hBMP-7基因转染入OVX大鼠BMSCs。观察转染后细胞形态及生长情况以及碱性磷酸酶（ALP）变化。结果荧光显微镜下,转染24h后即可见大量绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,基因转染效率高于70%。转染后细胞形态无明显改变,细胞增殖能力没有明显改变,ALP活性明显增高。免疫细胞化学染色结果表明,hBMP-7基因在OVX大鼠BMSCs中得到了有效的表达。结论重组腺病毒能够有效地将hBMP-7基因转染到OVX大鼠BM-SCs中,且hBMP-7能有效表达。基因转染对OVX大鼠BMSCs的增殖无明显影响,转染可促进OVX大鼠BMSCs向成骨细胞分化。