刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基在区分格特隐球菌与新生隐球菌中的应用

目的研究刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基(CGB培养基)在区分新生隐球菌和格特隐球菌中的作用。方法将已鉴定并报告为新生隐球菌的219株不重复的保存菌种经复苏后接种至CGB培养基进行筛选。对筛选阳性的菌株以及随机选择筛选阴性的菌株进行PCR扩增,将扩增的IGS1、URA5和GPD1基因产物进行测序,与基因库中的标准序列进行比对。结果既往报告为新生隐球菌的219株菌中,有3株在CGB培养基上生长且使菌落周围培养基颜色变为蓝色,筛选为阳性,其余216株在CGB培养基上虽有生长,但培养基颜色无变化;3株显色阳性菌经基因扩增和测序鉴定为格特隐球菌,2株显色阴性菌基因扩增及测序鉴定为新生隐球菌格鲁比变种。结论格特隐球菌在CGB培养基上生长产生明显的颜色变化,可用于其与新生隐球菌的鉴定。     

新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的分子鉴定

目的 评价限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法检测α和a交配型位点内GEF1α/a基因片段在鉴定新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型中的作用.方法 筛选交配型位点内的GEF1α/a基因进行PCR-RFLP分析.根据各基因型和交配型参考株的GEF1α/a基因保守序列设计引物,扩增受试新生和格特隐球菌GEF1α/a基因部分片段.利用DNAMAN和Vector NTI软件进行序列比对、限制性图谱分析、限制性内切酶的筛选和模拟电泳.选择EcoTl4 Ⅰ和Hap Ⅱ限制性内切酶分别对125株新生和格特隐球菌的GEF1α/a基因扩增片段进行RFLP分型.结果 所有受试的82株新生隐球菌和43株格特隐球菌均扩增出1 300 bp大小片段,而罗伦隐球菌、白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、阿萨希毛孢子菌、烟曲霉和黄曲霉参考株均扩增阴性.RFLP分型准确鉴定所有125株新生和格特隐球菌的种、变种、基因型和交配型.结论 针对GEF1α/a基因片段的PCR-RFLP方法特异性高、稳定性好,适用于新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的同步和快速鉴定以及进一步的分子流行病学分析.     

MALDI-TOFMS快速鉴定耐万古霉素屎肠球菌及其流行病学分型性能分析

目的利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速鉴别van A型万古霉素耐药屎肠球菌(VREfm)和万古霉素敏感屎肠球菌(VSEfm),并对VREfm进行流行病学相关性分析。方法收集139株屎肠球菌临床分离株,其中VREfm66株、VSEfm73株。采用聚合酶链反应(PCR)确定66株VREfm的万古霉素耐药基因。采用MALDI-TOFMS鉴定屎肠球菌。随机选取45株VREfm和50株VSEfm,采用ClinProTools 3.0软件对质谱峰进行分析并建立模型,用最佳模型验证另外的21株VREfm和23株VSEfm。随机选取21株VREfm进行多位点序列分型(MLST)分析,并采用MALDI-TOF MS对其进行层次聚类分析。结果 MALDI-TOF MS鉴定出所有菌株均为屎肠球菌,鉴定分值为2.321～2.602。66株VREfm均为vanA基因型。采用ClinProTools 3.0软件建立的最佳模型进行外部验证时,敏感性和特异性分别为95.2%和95.7%。21株VREfm共有7种序列分型(ST)型别,以ST78最常见。MALDI-TOF MS将21株VREfm分为4个集群,绝大多数ST78菌株被归于同一集群,与ST78高度相关的其他ST型别也被归于此集群。结论在严格控制实验条件的前提下,MALDI-TOF MS可快速区分vanA型VREfm和VSEfm,但无法区分与VREfm高度相关的ST型别。     

格特隐球菌基因组学研究进展

格特隐球菌属于新生隐球菌复合体, 既往被认为是新生隐球菌复合体的变种, 但最终被确立为独立的物种。与新生隐球菌不同, 格特隐球菌多感染免疫力正常人群, 目前致病机制尚未明确。格特隐球菌的基因组学研究不仅可全面了解其基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点, 还可对致病相关基因和重要蛋白进行预测, 为疫苗和新型抗生素的研发提供分子基础, 并进一步为高效治疗和防控隐球菌病提供理论依据。本文就格特隐球菌的基因组测序和基本特征、基因组进化、重要毒力基因以及比较基因组研究予以概述。     

格特隐球菌基因组学研究进展

格特隐球菌属于新生隐球菌复合体,既往被认为是新生隐球菌复合体的变种,但最终被确立为独立的物种。与新生隐球菌不同,格特隐球菌多感染免疫力正常人群,目前致病机制尚未明确。格特隐球菌的基因组学研究不仅可全面了解其基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点,还可对致病相关基因和重要蛋白进行预测,为疫苗和新型抗生素的研发提供分子基础,并进一步为高效治疗和防控隐球菌病提供理论依据。本文就格特隐球菌的基因组测序和基本特征、基因组进化、重要毒力基因以及比较基因组研究予以概述。     

微小RNA-146a在新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1细胞炎性反应中的机制研究

目的观察并分析微小RNA-146a(miR-146a)在新生隐球菌(标准株WM148)、格特隐球菌(标准株R265)刺激人单核巨噬细胞系(THP-1细胞)中表达的差异,探讨miR-146a在隐球菌所致隐球菌脑膜炎中的调控作用及机制。方法体外培养的人单核巨噬细胞系THP-1细胞分成新生隐球菌诱导组、格特隐球菌诱导组,按灭活菌数∶THP-1=5∶1的比例与THP-1细胞共孵育0、3、6、9和12 h后离心收集上清液和细胞沉淀。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测各组细胞miR-146a的表达情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的释放量。结果新生隐球菌诱导组细胞中miR-146a表达量与0 h相比明显升高(P0.01),且在3 h达到峰值,随后呈下降趋势;上清液中TNF-α的表达量在诱导后12 h达到最高值,IL-6的表达各时间点没有明显变化。格特隐球菌诱导后,miR-146a的表达逐渐升高,12 h达到最高值,但3 h、6 h点变化与0 h比较差异并无统计学意义;上清液中TNF-α的表达12 h到达峰值;IL-6的表达逐渐增加,12 h达到最高值,变化无统计学意义。结论新生隐球菌、格特隐球菌刺激THP-1细胞炎性反应后,miR-146a表达随时间延长呈现不同的规律,TNF-α、IL-6的动态变化表现不同的特点。研究表明新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1炎性反应可能存在不同的调控机制。     

129株新型隐球菌基因型及感染人群研究

目的明确我国新型隐球菌临床株的基因型及感染人群。方法利用流行病学、PCR指纹和多位点序列分型（MLST）方法对1980至2006年我国18个省、市的129株新型隐球菌临床分离株进行分析。结果71．0％（91／129）的菌株分离自无明显免疫缺陷的患者,8．5Yoo（11／129）分离自艾滋病患者,20．9％（27／129）分离自有其他基础疾病的非HIV感染者,进一步PCR指纹和MLST分析显示,我国血清A型新型隐球菌基因型不同于已知的VNI各亚型,我们将其命名VNIC型。结论129株新型隐球菌临床分离株主要感染人群为无明显免疫缺陷者,与国外报道不同,基因亚型的不同可能是导致我国与国外新型隐球菌感染人群差异的重要因素。     

华东地区新生隐球菌药物敏感性分析

目的探索近年来华东地区分离的新生隐球菌临床株对常用抗真菌药物的体外敏感性。方法采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的M27-A3肉汤微量稀释法检测氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑对新生隐球菌临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)范围,并通过内转录间隔区(ITS)测序法对检测出的耐药和剂量依赖性敏感(SDD)菌株进行进一步鉴定。结果抗真菌药物对96株新生隐球菌的MIC90(MIC范围)为:氟康唑4(0.5~16)μg/m L,氟胞嘧啶4(0.25~64)μg/m L,两性霉素B 0.5(0.03~1)μg/m L,伊曲康唑0.5(0.03~1)μg/m L,伏立康唑0.25(0.03~0.5)μg/m L,所有耐药菌株及SDD菌株的分子鉴定均为新生隐球菌格鲁比变种。结论除伊曲康唑外,华东地区新生隐球菌临床株对抗真菌药物的敏感性高,耐药菌株少,不敏感株以新生隐球菌格鲁比变种为主。     

格特隐球菌感染的临床特征与实验室研究进展

格特隐球菌主要感染免疫力正常人并以肺部感染为主,格特隐球菌感染的临床特征、治疗、预后、影像学特点、实验室检查等均与新生隐球菌有所不同。文章对格特隐球菌感染的临床特征和实验室检查方法作一综述。     

MALDI-TOF MS技术在鲍曼不动杆菌鉴定及同源性分析中的应用

目的评价基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对我院鲍曼不动杆菌属的鉴定及同源性分析的能力。方法对2014年9月至2015年2月我院29株经PhoneixTM100全自动微生物鉴定仪鉴定为鲍曼不动杆菌属的菌株进行MALDI-TOF MS鉴定,用MALDI-Biotyper软件进行同源性分析,并用16S rRNA基因测序进行验证。结果 MALDI-TOF MS鉴定结果为鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)26株,院内不动杆菌(Acinetobacter nosocomialis)3株。MALDI-TOF MS鉴定为院内不动杆菌的3株菌株的16S rRNA基因测序结果显示,2株为院内不动杆菌,1株为鲍曼不动杆菌。26株质谱鉴定为鲍曼不动杆菌的菌株分为2大簇(Ⅰ型,Ⅱ型),Ⅱ型又分为2小簇(Ⅱa、Ⅱb)。Ⅰ型、Ⅱ型分布在我院4个病区。结论MALDI-TOF MS技术鉴定鲍曼不动杆菌精准,可以鉴别鲍曼不动杆菌和院内不动杆菌。MALDI-Biotyper数据库软件进行同源性分析十分快捷。     

致血液感染的活泼瘤胃球菌的分离与鉴定

目的鉴定1株临床分离活泼瘤胃球菌。方法取2020年8月就诊于海南省人民医院的1例败血症患者的血液标本进行细菌培养、革兰染色,采用Vitek 2 Compact生化鉴定和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合16S rRNA PCR扩增及测序鉴定分离株。结果该分离菌为革兰阳性链球菌,专性厌氧,MALDI-TOF MS鉴定置信度为83.7%;16S rRNA PCR产物为1446 bp,与已知活泼瘤胃球菌ATCC 29149^T序列号(NR 036800.1)16S rRNA基因同源性为99%,由分离株的系统进化树可知,该分离菌与标准菌株活泼瘤胃球菌ATCC 29149^T位于同一分支。结论常规生化方法无法鉴定出该菌,16S rRNA检测与MALDI-TOF MS结合可用于活泼瘤胃球菌鉴定。     

28株隐球菌ITS基因序列测定及其系统进化分析

目的 测定28株鸽粪中分离的隐球菌的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,并根据ITS序列构建28株隐球菌和6株新生隐球菌的系统进化树。 方法 应用neighbor-joining(NJ)和maximum parsimony(MP)方法构建系统进化树,研究隐球菌属不同菌种间的亲缘和进化分化关系。 结果 两种聚类方法得到的进化树模型基本一致,所有菌株聚类为3个主要分支:6株分离到的新生隐球菌和6株参考菌株为一支;大部分DHP和XSQ菌株聚为一支, 除HP6外,所有的HP菌株和XSQ46-1及XSQ59-3,聚类为平行的第3个分支。从分化远近看,新生隐球菌分支、DHP和XSQ分支的分化年代没有显著差异。 结论 隐球菌属中,所有的新生隐球菌聚类为一支,其余的隐球菌菌种均分散在不同分支中,没有明显的种属聚集性,即呈现了隐球菌属不均一的特性。     

国内三家医院33 例临床隐球菌病病原菌分离、药敏试验和临床分析

目的 了解国内三家医院临床确诊隐球菌病的分布、药敏试验、临床特点以及抗生素治疗等，提高临床对隐球菌病临床特征的认识。方法 回顾性分析2018 ～ 2019 年国内三家医疗机构33 例确诊隐球菌病患者的临床表现、治疗、预后及实验室检查和药敏结果。结果 33 例隐球菌病患者（男性25 例，女性8 例）平均年龄50.4±12.6 岁，10 例无基础疾病。33 株隐球菌中新生隐球菌31 株，格特隐球菌2 株，其中16 株(48.5%) 来自脑脊液，7 株(21.2%) 来自肺穿组织。常见的中枢神经系统的临床症状有发热18 例，头痛14 例，恶心呕吐9 例。药敏结果显示，所有菌株对两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑均没有获得耐药；1 株对氟胞嘧啶有获得性耐药。脑隐球菌病主要选择两性霉素B 进行治疗，肺隐球菌病选择氟康唑，好转15 例，死亡3 例，转院8 例，另有7 例未经治疗转院。结论 隐球菌对人类致病的主要是新生隐球菌和格特隐球菌。中枢神经系统症状以发热、头痛和恶心呕吐最常见，单纯肺隐球菌病无典型的中枢神经系统的症状；绝大多数菌株均没有获得耐药；临床应重视病原学检测，及时使用抗真菌治疗，对疾病的诊治和预后十分重要。     

隐球菌检验方法的应用

正隐球菌是广泛存在于自然界中的一种真菌,其中包括新生隐球菌、格特隐球菌等变种。新生隐球菌可引起条件致病性感染,其感染主要发生在免疫力低下的人群,如AIDS患者、器官移植后患者或长期使用糖皮质激素的患者等。新生隐球菌是一种类酵母样真菌,广泛存在于鸽子的粪便、灰尘中等,可经呼吸道、消化道等途径进入人体引起隐球菌病。新生隐球菌菌体周围有一圈宽厚的荚膜,是其重要的致病物质,有抑制人体内免疫细胞吞噬、促使和诱导动物免疫无应答、降低人体对病原菌抵抗力的     

两种MALDI-TOF MS系统快速鉴定血培养中白念珠菌以外酵母样真菌

目的评价2种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)系统(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)在快速鉴定血培养中分离的白念珠菌以外酵母样真菌的应用。方法收集复旦大学附属中山医院2010年10月至2013年1月住院患者血培养中分离的白念珠菌以外酵母样真菌59株,以真菌内转录间隔区(ITS)测序鉴定结果为金标准,比较Autoflex MALDI-TOF MS、Vitek MALDI-TOF MS和API 20C AUX 3种系统鉴定的准确性。结果 59株菌株包含了11种真菌,其中近平滑复合体30株(占50.8%)、热带念珠菌11株(占18.6%)、光滑念珠菌8株(占13.6%)、克柔念珠菌2株(占3.4%)、新生隐球菌2株(占3.4%)、异常威克汉姆酵母2株(占3.4%)、季也蒙念珠菌复合体1株(占1.7%)、葡萄牙念珠菌1株(占1.7%)、阿萨希毛孢子菌1株(占1.7%)和酿酒酵母1株(占1.7%)。3种系统鉴定真菌总的准确性分别为Autoflex MALDITOF MS 93.2%、Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%,2种MALDI-TOF MS比较,差异无统计学意义(P=0.155)。其中对白念珠菌以外酵母样真菌的鉴定准确性分别为Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%、Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%,2种MALDI-TOF MS比较,差异具有统计学意义(P=0.006)。对念珠菌属外的少见真菌鉴定准确性分别为Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS66.6%和API 20C AUX 33.3%。结论 MALDI-TOF MS系统和目前常规生化鉴定方法相比,具有快速、操作简便、结果准确等优点;对于临床血培养分离真菌的鉴定,Autoflex MALDI-TOF MS鉴定准确性和Vitek MALDI-TOF MS相似,但对常见非白念珠菌的鉴定,Autoflex MALDI-TOF MS鉴定准确性优于Vitek MALDI-TOF MS。     

基于重组甘露糖结合凝集素蛋白–磁珠富集技术检测血流感染新型隐球菌的方法

目的建立一种基于重组甘露糖结合凝集素（MBL）蛋白–磁珠富集技术快速检测血流感染新型隐球菌的方法，为临床确诊新型隐球菌感染提供指导。方法利用Western blot方法检测重组MBL蛋白（M1）与新型隐球菌定性结合的情况；利用磷酸缓冲盐溶液（PBS）与兔血模拟样本检测M1-protein A磁珠对不同浓度梯度的新型隐球菌的捕获情况；比较3种不同方法［方法1，M1-protein A磁珠富集后直接进行qPCR鉴定；方法2，M1-protein A磁珠富集后培养加质谱鉴定；方法3（金标准），血培养加质谱鉴定］检测血液新型隐球菌的优劣。结果M1蛋白与新型隐球菌标准株及临床株普遍结合；不同浓度梯度新型隐球菌的PBS与兔血模拟阳性样本中，M1-protein A磁珠复合体的富集效率为18.00%～83.00%；3种新型隐球菌鉴定方法中，方法1耗时最短（4.25 h），灵敏度为10菌落形成单位/毫升（CFU/ml）；方法2灵敏度可达到≤ 1 CFU/ml，总时间57 h；作为临床诊断金标准的方法3灵敏度虽也能达到≤1 CFU/ml，但耗时较长，需120 h。结论采用磁珠富集结合qPCR、MALDI-TOF MS技术，比传统血培养大大缩短了检测时间，并且具有较高的灵敏度和特异度。     

四川省自贡市食品和环境携带屎肠球菌的耐药性和多位点序列分型研究

目的 研究四川省自贡市食品和环境样本中屎肠球菌耐药性及携带毒力基因情况,并对分离菌株进行序列分型（ST）。方法 对2013年采集的157份食品和环境样本进行屎肠球菌分离鉴定,全自动微生物鉴定仪检测屎肠球菌对14种常见抗生素的敏感性;使用聚合酶链式反应方法检测屎肠球菌携带毒力基因（hyl,esp）的情况,并应用多位点序列分型（MLST）方法对分离菌株进行序列分型。结果 自贡地区肉制品和冰箱拭子样本屎肠球菌分离率为28.03%（44/157）,其中耐药菌株的比例为86.36%（38/44）。分离菌株对红霉素、四环素和利福平的耐药率分别为65.91%（29/44）、31.82%（14/44）和27.27%（12/44）,对环丙沙星,高浓度链霉素和高浓度庆大霉素以及氯霉素也有一定的耐药率。分离到1株喹奴普丁-达福普丁耐药的菌株。未检测到对青霉素类、糖肽类、脂肽类、喹诺酮类和恶唑烷酮类抗生素耐药的菌株。44株屎肠球菌分为38个ST型别,ST94克隆群为优势克隆群,包括13株菌。分离到1株CC17克隆群的屎肠球菌多重耐药菌株和1株ST957的八重耐药菌株。检测到2株携带esp基因的屎肠球菌。结论 自贡市食品和环境中存在多种ST型别的屎肠球菌,且对多种抗生素耐药。应重视肉制品中耐药屎肠球菌对公众健康的潜在威胁。     

MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的研究

目的探索基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)进行同源性分析在临床实验室应用的可行性。方法以多位点序列分型(MLST)方法对95株CRKP分型结果为标准,采用MALDI-TOF MS技术对上述95株CRKP分析后的聚类分析结果进行一致性比较,观察MicroflexTM质谱仪对CRKP的分型能力。结果 MicroflexTM质谱仪聚类分析结果显示95株菌分为2大类,5个亚类。其中Ⅰb和Ⅰc亲缘关系较近,Ⅰa与Ⅰb、Ⅰc较远;与MLST结果相比较,ST1、ST15分布在Ⅰb亚类中;ST1198、ST152、ST1030、ST1254分布在Ⅱa亚类中;ST2260、ST2928分布在Ⅱb亚类中,其余87株ST11型分布在各亚类中。结论 MALDI-TOF MS聚类分析结果与MLST结果并不一致,MALDITOF MS应用于同源性分析还需更详细的研究。     

粪肠球菌耐庆大霉素基因的检测及分子流行病学研究

目的探讨患者医院内下呼吸道分离的粪肠球菌耐庆大霉素基因特点及粪肠球菌感染的分子流行病学。方法应用PCR技术检测庆大霉素高水平耐药株（HLGR）耐药基因及应用随机扩增多态性DNA分型法（RAPD）进行分子流行病学研究。结果48株下呼吸道痰标本分离的肠球菌均为粪肠球菌，其高水平庆大霉素的耐药率为87．5％，基因型均为aac（6′）-Ie-aph（2″）-Ia，为单一基因型，未发现aph（2″）-Ib、aph（2″）-Ic及aph（2″）Id基因型。对DNA的指纹图谱行聚类分析可分为3种基因型，命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，3个类型各个病区均有分布。结论根据粪肠球菌耐高水平庆大霉素的基因型选择有效的抗菌药物，我院分离的粪肠球菌其基因型不一致，无明显的优势菌株。     

IS6110限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的 评价IB6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学上的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法 收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果 （1）IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。（2）将本次试验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果 有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。（3）广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论 同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。