Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

全脑缺血再灌注损伤大鼠早期脑皮质超微结构的变化

背景：大量研究报道了全脑缺血再灌注损伤模型形态学上的变化，但是，再灌注早期皮质超微结构的变化、特别是血脑屏障的变化报道较少。目的：探讨全脑缺血再灌注损伤大鼠早期脑皮质神经元、胶质细胞和血脑屏障的变化，为临床治疗提供可靠的依据。设计：随机对照的实验研究。单位：北京天坛医院神经外科、麻醉科和电镜室。材料：实验于2003—02／2004—02在首都医科大学附属北京神经外科研究所对6只Wistar大鼠进行研究。随机分为2组，缺血再灌注组(3只)和假手术对照组(3只)。干预：制备大鼠全脑缺血再灌注模型。缺血组于缺血再灌注1h、假手术组于手术后1h取脑，利用电镜技术观察皮质超微结构的变化。主要观察指标：皮质超微结构变化。结果：缺血再灌注早期(1h)皮质神经细胞发生不同程度的固缩。胶质细胞肿胀，核内染色质溶解，核膜不清。血管周围足突轻度肿胀、与基膜分离。微管有部分溶解。结论：再灌注损伤早期皮质神经元、胶质细胞、细胞骨架和血脑屏障即发生变化。提示降低脑水肿、保护血脑屏障等脑保护治疗应越早越好。     

单磷酰脂A和缺血预处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡 Bcl-2 Bax蛋白表达的影响

目的 研究单磷酰脂A预处理(MLA-P)和缺血预处理(IP)对大鼠缺血/再灌注(I/R)心肌细胞凋亡及相关基因 Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法 复制I/R损伤模型,采用末端标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡;应用免疫组化SABC法检测Bcl-2和Bax蛋白表达。结果I/R组凋亡细胞较多,MLA-P组及IP组凋亡细胞明显少于I/R组(P<0.01)。Bcl-2和Bax蛋白表达在I/R组均较多,MLA-P组及IP组Bcl-2表达明显高于I/R组(P<0.01),而Bax蛋白表达明显低于I/R组(P<0.01)。MLA-P组与IP组各指标均无显著性差异(P>0.05)。结论 MLA-P可抑制I/R诱发的心肌细胞凋亡,Bcl-2和Bax蛋白表达在心肌凋亡的发生中起重要作用。MLA-P与IP两者对心肌细胞凋亡及相关基因表达影响的作用相近。     

大鼠脑缺血再灌注后缺血侧半球皮质与缺血核心区皮质TNF-α含量的对比研究

目的 观察大鼠脑缺血再灌注后所血侧半球皮质和缺血核心区皮质内肿瘤坏死因子（TNF－α）含量的变化。方法 将大鼠随机分为缺血侧半球组和缺血核心区组，右侧大脑中动脉闭塞2h，于再灌注后0、6、16、24和48h处死大鼠，用ELISA法分别测定缺血侧半球皮质和缺血核心区皮质内TNF－α含量。结果 缺因侧半球皮质内TNF－α含量于脑缺血再灌注后6h明显升高，16h达高峰，24h恢复到正常水平，48h再次明显升高。缺血核心区皮质内TNF－α含量于脑缺血再灌注后无明显变化。结论 TNF－α参与了脑缺血再灌注后缺血核心区以外皮质内的损伤反应过程，而与缺血核心区皮质内的损伤反应可能无关。     

全脑缺血再灌注损伤大鼠早期脑皮质超微结构的变化

背景大量研究报道了全脑缺血再灌注损伤模型形态学上的变化,但是,再灌注早期皮质超微结构的变化、特别是血脑屏障的变化报道较少.目的探讨全脑缺血再灌注损伤大鼠早期脑皮质神经元、胶质细胞和血脑屏障的变化,为临床治疗提供可靠的依据.设计随机对照的实验研究.单位北京天坛医院神经外科、麻醉科和电镜室.材料实验于2003-02/2004-02在首都医科大学附属北京神经外科研究所对6只Wistar大鼠进行研究.随机分为2组,缺血再灌注组(3只)和假手术对照组(3只).干预制备大鼠全脑缺血再灌注模型.缺血组于缺血再灌注1 h、假手术组于手术后1 h取脑,利用电镜技术观察皮质超微结构的变化.主要观察指标皮质超微结构变化.结果缺血再灌注早期(1 h)皮质神经细胞发生不同程度的固缩.胶质细胞肿胀,核内染色质溶解,核膜不清.血管周围足突轻度肿胀、与基膜分离.微管有部分溶解.结论再灌注损伤早期皮质神经元、胶质细胞、细胞骨架和血脑屏障即发生变化.提示降低脑水肿、保护血脑屏障等脑保护治疗应越早越好.     

肌苷对大鼠脑缺血再灌注后钙调神经磷酸酶和环氧合酶-2表达的影响

目的:研究肌苷对大鼠脑缺血再灌注后CaN和COX-2蛋白表达的影响,探讨其神经保护作用机制。方法:应用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型,腹腔注射肌苷(100mg/kg),采用免疫组织化学法检测肌苷对大鼠脑缺血再灌注不同时间内CaN及COX-2蛋白的影响。结果:①对照组皮质和纹状体区大鼠脑CaN蛋白表达在脑缺血再灌注6h开始增强,12-24h达高峰,随即下降,至3d已降至再灌注2h水平。与再灌注2h相比,6h-2d组均有显著差异(P<0.01)。肌苷组CaN表达于2h-14d较对照组显著降低(P<0.01)。②对照组皮质和纹状体区COX-2表达在脑缺血再灌注6h开始增强,24h-2d达高峰,然后逐渐降低,14天时几乎未检测到COX-2阳性细胞。与再灌注2h相比,6h-3d组差异均有显著性意义(P<0.01)。肌苷组COX-2表达于脑缺血再灌注2h-14d较对照组显著减低(P<0.01)。皮质中的阳性细胞数高于纹状体区。结论:肌苷对缺血后脑损伤的保护作用可能通过影响大鼠脑CaN、COX-2的表达而实现的。     

壳聚糖纳米粒载体转染铜超氧化物歧化酶对缺血再灌注脑组织的作用

背景：由于血脑屏障的存在，铜超氧化物歧化酶在临床应用中往往达不到其在体外对中枢神经细胞缺氧、复氧过程中的自由基清除效果。那么能不能利用壳聚糖纳米粒这一种新的基因载体来增强铜超氧化物歧化酶的治疗效果呢？目的：观察壳聚糖纳米粒一超氧化物歧化酶联合体对脑缺血再灌注脑组织氧自由基的清除能力。设计：观察实验。材料：铜超氧化物歧化酶质粒由解放军第四军医大学唐都医院中心实验室提供。36只大鼠制备缺血再灌注模型，随机分为3组：生理盐水对照组；生理盐水＋超氧化物歧化酶组；壳聚糖超氧化物歧化酶质粒治疗组。方法：以分子交联法制备壳聚糖纳米粒；通过静电吸附作用连接上超氧化物歧化酶质粒；将50．0μL纳米粒分别与10．0，25．0，50．0，75．0，100．0μL超氧化物歧化酶质粒混合，经琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖纳米粒与超氧化物歧化酶DNA的结合能力，并通过紫外分光光度计检测其包埋率。将生理盐水、超氧化物岐化酶、壳聚糖纳米粒一超氧化物歧化酶质粒联合体（体积比50：75）输注到缺血再灌注大鼠体内，然后测定大鼠脑海马组织内丙二醛水平及超氧化物歧化酶活性。主要观察指标：壳聚糖纳米粒与超氧化物歧化酶质粒的结合情况。各组大鼠脑组织中丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性。结果：壳聚糖纳米粒：超氧化物歧化酶质粒体积比为50：75时包埋率最大，为100％，且此种比例下有良好的DNA保护作用，不被DNaseI降解。经壳聚糖纳米粒-超氧化物歧化酶质粒联合体治疗的大鼠，其海马组织丙二醛水平明显低于生理盐水对照组及生理盐水＋超氧化物歧化酶组（P〈0．01和P〈O．05），超氧化物歧化酶活性明显高于生理盐水对照组及生理盐水＋超氧化物歧化酶组（P〈0．01和P〈0．05）。结论：壳聚糖纳米粒-超氧化物歧化酶质粒联合体在脑组织中具有较强氧自由基清除能力。     

心脏转录因子Nkx2．5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2．5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2．5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx25为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2．5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx25的PCR产物分别在双酶切后用,T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2．5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2．5基因编码区约1000bp的目的片段。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2．5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2．5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

脂氧素A4抑制NLRP3炎性体参与其抗脑缺血 再灌注损伤

目的:观察脂氧素A_4(LXA_4)对大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型大鼠缺血脑组织周边区域的NLRP3阳性神经元数量和NLRP3蛋白表达的影响。方法:SD雄性大鼠24只随机分为假手术组、MCAO/R组和LXA_4组,采用线栓法制作MCAO/R模型,LXA_4组大鼠侧脑室注射0.2 mmol/L LXA_45μL;观察各组脑梗死体积、神经行为学评分、病灶周围NLRP3阳性神经元数及NLRP3蛋白表达。结果:LXA_4明显降低了MCAO/R模型大鼠脑梗死体积和神经行为学评分,减少大鼠缺血灶周边NLRP3阳性神经元数量及NLRP3蛋白表达。结论:LXA_4抑制NLRP3炎性体信号通路可能是其抗脑缺血再灌注损伤的机制之一。     

高压氧对急性损伤期缺血再灌注大鼠脑内水通道蛋白-4表达的影响

【目的】研究水通道蛋白－4（AQP4）在缺血／再灌注脑损伤大鼠脑内的表达,及高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）对其表达的影响。【方法】将135只SD大鼠分为假手术对照组（Sham组）、缺血再灌注组（I／R组）和高压氧处理组（HBO组）,以四动脉阻断法建立全脑缺血再灌注大鼠模型。I／R组和HBO组按再灌注的时间不同分为四个亚组,每组15只,即动物缺血20min后分别再灌注6h、24h、3d和5d,HBO各亚组在再灌注后分别行不同次数的高压氧处理。测定脑组织含水量及伊文斯蓝含量,并采用免疫组织化学技术检测AQP4的表达。同时观察HB0对脑水肿和AQP4表达的影响。【结果]Sham组AQP4表达较低,在缺血损伤后表达升高,脑组织含水量及伊文斯蓝含量增加,给予HB0后AQP4的表达和脑组织含水量降低。【结论】缺血／再灌注脑损伤后AQP4表达上升,脑水肿明显,给予HB0可抑制AQP4的表达,减轻脑水肿。     

缺血后处理对脑缺血再灌注损伤后ERK1/2和Akt磷酸化及神经细胞凋亡的影响

目的:观察缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后ERK1/2和Akt及神经细胞凋亡的影响。方法:成年健康SD大鼠72只,随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、缺血后处理(Postcond)组各24只,应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型。分别于再灌注10min、30min、6h、24h后留取大脑皮质。Western blot检测再灌注10min、30min、6h后ERK1/2和Akt活性变化;原位末端标记(TUNEL)检测再灌注后24h神经细胞凋亡。结果:Postcond组再灌注10min、30min、6h后ERK1/2和Akt活性高于I/R组(P<0.05);脑缺血再灌注24h后,Postcond组与I/R组比较,TUNEL阳性细胞减少(P<0.05)。结论:缺血后处理可提高大鼠脑缺血再灌注后皮质内ERK1/2和Akt活性,减少神经细胞凋亡。     

Nrf2基因转染对缺血再灌注心肌炎症反应和氧化应激的影响

[目的]探讨心肌细胞过表达核因子相关因子2（Nrf2）基因后对缺血再灌注损伤导致的炎症反应和氧化应激的影响.[方法]30只SD大鼠随机分成3组（n=10）,A组为对照组,B组为缺血再灌注组,C组为Nrf2组.A组和B组经冠脉转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（Ad-EGFP）,C组转染携带Nrf2基因的腺病毒载体（Ad-Nrf2）至心肌组织.稳定3 d后,各组行心肌缺血再灌注损伤（或假实验）.光学显微镜下观察心肌的炎症改变,测定心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）的含量.[结果]缺血再灌注后,光镜下B组亚细胞结构损伤明显,C组结构损伤较B组明显减轻; B、C两组SOD的活性与A组比较明显降低（P〈0.05）,而B组明显低于C组（P〈0.05）;B、C两组MDA含量与A组比较明显升高（P〈0.05）,B组明显高于C组（P〈0.05）.[结论]过表达Nrf2基因能通过抗炎和抗氧化应激保护缺血再灌注心肌.     

针刺对脑缺血再灌注损伤相关免疫细胞活动的调节作用

缺血性脑血管病是临床的常见病和多发病,且病残率、病死率和复发率高。近年来研究表明,脑缺血再灌注后的炎症反应是导致继发性损伤的关键,免疫细胞作为脑缺血再灌注后炎症因子的靶细胞,向缺血区域浸润、聚集后,导致继发性神经元损伤和梗死面积的扩大,引起脑组织损伤。针刺调节脑缺血再灌注损伤相关免疫细胞活动的研究正逐步深入。     

复方虫草精华对心脏缺血/再灌注损伤的保护作用

目的：观察复方虫草精华（Lungfit)对大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤是否存在保护作用。方法：Lungfit分小、大两个剂量（160、325mg/kg.d^-1)给大鼠连续灌胃给药10天后，取心脏，用Langendorff装置逆行恒压灌流，左心室内置乳胶水囊和换能器相连，分别测定缺血前后各组心脏的心功能参数值。结果：缺血前，Lungfit灌胃大鼠离体心脏的各项心功能参数值与对照组相比无显著差异（P＞0．05）；缺血30min后的再灌注期间，Lungfit灌饲的大鼠心脏的心率、冠脉流量及心肌舒缩功能的改善明显优于对照组（P＜0．05或P＜0．01）。结论：Lungfit对心肌缺血／再灌注损伤具有保护作用。     

川芎嗪对局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的：探讨川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法：SD大鼠18只随机分为3组各6只：A组为假手术组，B组为缺血再灌注组，C组为川芎嗪干预组。采用免疫组化与医学图像分析检测大鼠大脑皮层Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞的数目、平均灰度。结果：B组与A组比较损伤侧脑组织Bcl-2、Bax蛋白阳性细胞数目均增多，平均灰度均降低（P〈0．01）；C组与B组比较Bcl-2蛋白阳性细胞数目增多，平均灰度降低，Bax蛋白阳性细胞数目减少，平均灰度升高（P〈0．05）。结论：局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表达增强；川芎嗪可上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白的表达，这可能是川芎嗪治疗缺血性脑血管病的机制之一。     

加贝酯对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

[目的]探讨加贝酯对SD大鼠肝脏抗缺血再灌注损伤（HIRI）的效应及其可能的机制。[方法]采用Pringle＇s法建立大鼠HIRI模型,将40只SD大鼠随机分成四组,每组10只：A组（假手术组）、B组（模型组）、C组（加贝酯处理组）、D组（盐水对照组）。分别测定血浆中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）浓度;测定肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量及光镜观察各组病理形态学变化。[结果]B、C、D三组ALT、AST、MDA均显著高于A组（P〈0．05或P〈0．01）,B、D两组又显著高于C组（P〈0．01）;A组的SOD含量明显地高于其他三组,而C组又明显地高于B、D两组（P〈0．01）。光镜下观察肝组织形态学变化,A组形态基本正常;B、D两组损伤最严重;而C组较B、D两组轻微。[结论]肝脏缺血再灌注时,肝细胞功能受损,蛋白酶抑制剂加贝酯能明显减轻这种损伤,保护肝功能。     

兔肾缺血再灌注损伤时肠系膜微循环和血液流变性变化及PGI2的影响

目的观察兔肾缺血再灌注(IR)损伤时肠系膜微循环和血液流变性变化,并探讨前列腺素I2(PGI2)对兔肾IR损伤的预防作用及可能机制.方法日本大耳白兔18只,随机均分为假手术组(Contro1)组、单纯缺血再灌注(IR)组和缺血再灌注 前列腺素I2(IR PGI2)组.运用微循环显微镜自动摄像分析系统,于肾缺血60min和再灌注120min时动态观察肠系膜微血管管径、血流速度、白细胞粘附、白微栓及管周出血情况,并测定血液流变学指标.结果与Control组比较,IR组的缺血期和再灌注期,肠系膜微动、静脉管径减小(P<0.01或P<0.05),血流速度明显减慢(P<0.01),白细胞粘附聚集、白微栓及管周出血增多(P<0.01),以血粘度增高为主的多种血液流变学指标异常(P<0.01或P<0.05).IR PGI2组微动、静脉管径、血流速度、白细胞粘附、白微栓及管周出血与IR组比较差异显著(P<0.01),血液流变学指标较IR组明显改善(P<0.01或P<0.05);与Control组比较,除微动、静脉管径明显增大(P<0.01)外,其余指标差异均无显著性(P>0.05).结论肾IR机体微循环和血液流变性明显异常,PGI2具有改善肾IR损伤时微循环和血液流变性异常的作用.     

红景天对大鼠脑缺血再灌注c-Fos表达及神经细胞凋亡的影响

目的探讨红景天对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中c-Fos 表达水平及神经细胞凋亡的影响。方法Wistar 大鼠120 只,分为假手术组、模型组和干预组(红景天),各组再分为3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 共5 个亚组,每个亚组8 只大鼠。后两组采用大脑中动脉线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,干预组术前红景天每天0.672 g/kg 灌胃15 d。参考Longa 法在大鼠麻醉清醒后进行评分,应用免疫组化、TUNEL法检测各组c-Fos 表达及神经细胞凋亡。结果模型组和干预组缺血脑组织中c-Fos 表达明显增加(P<0.01),于再灌注48 h 达高峰;与模型组相比,干预组c-Fos 表达减少(P<0.05),神经元凋亡明显减少(P<0.01),神经功能缺损评分下降(P<0.05)。结论红景天能抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织中c-Fos 表达,减少神经元凋亡,减轻缺血再灌注损伤。