联合应用成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法及IL-2基因疗法对肿瘤的治疗作用

本实验观察了成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法对大剂量化疗后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果发现:接受G-CSF基因治疗的实验小鼠外周血白细胞尤其是中性粒细胞降低程度明显减弱,恢复速度明显加快;并可明显促进血小板的恢复,但作用较缓;其脾脏和骨髓CFU-GM、CFU-MK、CFU-S水平显著地高于对照组,表明成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法可显著降低大剂量化疗后造血损伤程度,并明显加速受损的造血功能的恢复。     

逆转录病毒载体介导人 GM-CSF 基因在 HL-60 白血病细胞的高效转移和表达

目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性，为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７，获得重组逆转录病毒，将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞，经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群，应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移并整合到ＨＬ－６０细胞基因组中，而未转基因和转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经ＰＣＲ检测未能扩增出特异性片段。经ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１检测，转基因细胞分泌的ＧＭ－ＣＳＦ生物学活性为６０～２００ｎｇ／ｍｌ（细胞１×１０６，培养２４小时），而未转基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞培养上清无ＧＭ－ＣＳＦ活性。结论逆转录病毒载体介导的ｈＧＭ－ＣＳＦ基因能在体外培养的人ＨＬ－６０白血病细胞中获得高效的转移和表达。     

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo~R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.     

G-CSF与GM-CSF序贯联合治疗化疗后骨髓抑制的研究

目的　探讨粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)和粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF)序贯联合治疗化疗后骨髓抑制的疗效。方法　采用随机单盲的方法 ,将化疗致骨髓抑制的 87例患者 ,分为G -CSF→GM -CSF组、GM -CSF→G -CSF组给药治疗。于用药后第 3、6、9、12、16、2 0天进行外周血白细胞、中性粒细胞、血小板计数。结果　用药后第 3天 ,白细胞计数 >8.0× 10 9/L者 ,共有 18例被退出 ,69例进入随后的研究。用药后第 6天 ,G -CSF→GM -CSF组的白细胞及中性粒细胞计数高于GM -CSF→G -CSF组 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;第 9、12天无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;第 16、2 0天 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 )。用药后 2组血小板计数均增高 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　G -CSF→GM -CSF序贯用药治疗肿瘤患者化疗后骨髓抑制的疗效优于GM -CSF→G -CSF ,而不良反应不加重     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因定位与克隆和细胞表达

近年来,生物化学技术的发展使细胞因子的鉴定、研究进入了一个新阶段,以后新的细胞因子不断被发现,目前已有几十种。各种细胞因子的基因结构得到了初步的认识。本文就粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因定位与克隆和细胞表达作一简单综述。1 G-CSF基因定位与克隆和细胞表达 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)又称为集落刺激因子3(CSF-3)、粒细胞-巨噬细胞分化蛋白     

粒细胞集落刺激因子促进多发性骨髓瘤化疗后中性粒细胞恢复的观察

G－CSF对实体瘤、白血病化疗后WBC和ANC减少症的防治作用已经得到了肯定,但对多发性骨髓瘤(MM）化疗后WBC和ANC减少症的防治作用尚未见报告。我科于1995年8月至2000年8月应用低剂量G－CSF[(2～3μg／kg·d）]对MM化疗后WBC和ANC减少的防治作用及毒副反应进行了观察,现将结果报告如下。1 材料与方法1．1临床资料入组28例,其中男性16例,女性12例;年龄29～78岁,平均年龄59岁。使用G－CSF前均无严重肝、肾、心、肺功能障碍,共化疗54个疗程。1．2 方法采用自身对照法。具体方法：1）给药疗程：患者接受联合化疗后WBC降至2…     

G-CSF/GM-CSF序贯给药与G-CSF单药防治化疗后骨髓抑制的对比研究

目的;对比研究低剂量C－CSF／GM－CSF序贯给药与G－CSF单药预防化疗所致白细胞减少,血小板降低的临床效果及不良反应。方法：采用随机单盲研究方法,将50例肿瘤化疗患者随机分成A组和B组。A组于化疗后第7－9日皮下注射G－CSF,10－12日皮下注射GM－CSF9均为2.5μg/kg);B组化疗后第7－12日皮下注射G－CSF（2.5μg/kg）。结果：G／GM－CSF序贯给药和G－CSF单药均可明显减轻化疗所致WBC和ANC的下降程度,降低化疗延迟率及延迟时间,提高化疗完成率。G／GM－CSF序贯给药还可以提高化疗后的单核细胞和血小板的数量,减少血小板成分输血。主要不良反应如发热,注射部位疼痛,骨骼肌肉疼痛等两组相似,且可以耐受。结论：序贯联合应用低剂量G－CSF和GM－CSF可有效防治白细胞,血小板的降低,减少成分输血的次数,提高化疗完成率,是防治化疗所致骨髓抑制有效的方法。     

重组人粒细胞集落刺激因子促进自体造血干细胞移植后造血功能恢复的临床研究

背景与目的:高剂量化放疗联合自体造血干细胞移植(autologoushematopoieticstemcellstransplantation,AHSCT)能够提高某些实体瘤的疗效,该疗法的成功得益于重组人粒细胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactor,rhG-CSF)的运用。本研究的目的是观察rhG-CSF对实体瘤患者自体造血干细胞移植后造血功能重建的影响。方法:将接受AHSCT的130例实体瘤患者分为rhG-CSF组和对照组,rhG-CSF组在造血干细胞回输后第6天开始连日给予rhG-CSF250～300μg/d,皮下注射,直至白细胞(whitebloodcell,WBC)≥5.0×109/L为止;对照组在造血干细胞回输后不给予rhG-CSF。结果:130例患者共完成移植132次,其中2例为2次移植。研究早期的24例患者采取自体骨髓移植,其中12例移植后给予rhG-CSF;此后的106例均采用自体外周血造血干细胞移植(2例为2次移植),其中47例移植后给予rhG-CSF。(1)rhG-CSF组和对照组自体骨髓移植患者住无菌病房的中位时间为33天和41天,WBC恢复到1.5×109/L以上的中位时间为14天和24天,两组之间的差异有显著性(P<0.05);两组血小板(platelet,PLT)恢复到20×109/L及50×109/L以上的中位时间均无显著性差异。(2)rhG-CSF组和对照组自体外周血干细胞移植患者住无菌病房的中位时间为17天和20天,     

环磷酰胺联合G-CSF动员外周血造血干细胞的实验和临床观察

目的评价环磷酰胺(CTX)联合G-CSF(粒细胞集落刺激因子)对自体外周血造血干细胞(PBSC)的动员效果和毒性反应.方法CTX 3.5～4g/m2第1、2天静滴,WBC降至最低点时开始注射G-CSF 4.5(3.5～5)μg/kg@天,至PBSC采集结束.当WBC恢复至(1.9～3.0)×109/L以上,以及MNC(单个核细胞)≥20%～30%和外周血CD34+≥1%时采集APBSC,当累计采集MNC≥2.0×108/kg和CD34+细胞≥2.0×106/kg时停止采集.结果23例患者经CTX+G-CSF动员后第9(7～10)天WBC最低,为0.65(0.25～0.9)×109/L,G-CSF给药开始时间为动员后第10(8～11)天,持续6.5(5～11)天,第13(11～20)天开始采集PBSC,持续2天,采集得MNC 2.5(1.3～8.9)×108/kg,CFU-GM 6.8(2.8～11.6)×105/kg,CD34+细胞4.9(2.5～8.9)×106/kg,1例患者出现心包炎,无其他严重毒性反应;21例接受自体外周血干细胞移植支持下超大剂量化疗均获得满意造血重建.结论CTX联合G-CSF是高效和安全的PBSC动员方案,值得临床广泛应用.     

STAT3介导G-CSF对原代APL细胞增殖的调控作用

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导后,白细胞介素(IL)-1β和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对原代急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞增殖调控的信号传导因子。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定原代APL细胞培养上清中IL-1β和G-CSF水平的变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定IL-1β和G-CSF mRNA表达水平。Western blot测定信号转导和转录激活因子(STAT)1α和STAT3表达水平变化。结果ATRA治疗后APL患者外周血白细胞明显升高,平均12天达到高峰,并且以中晚幼粒细胞为主。ATRA治疗后7天和高峰期的APL细胞体外培养24h后,IL-1β( P＜0．05)和G-CSF(P＜0．05)分泌水平显著升高。RT-PCR结果表明分泌IL-1β和(或)G-CSF升高的原代APL细胞,IL-1β和(或)G-CSF mRNA表达升高。所有患者原代APL细胞的STAT1α蛋白表达均升高,与IL-1β或G-CSF的表达无关。但STAT3的升高却与G-CSF表达和分泌水平变化相一致。结论ATRA诱导高表达的G-CSF,通过STAT3发挥对原代APL细胞的调节作用。     

人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

活化骨髓是指在体外经IL-2激活后具有抗瘤活性和造血功能的一类骨髓细胞;与LAK细胞相比具有广谱,高效的杀伤活性及低IL-2依赖性等特征。文献报道活化骨髓移植能产生移植物抗白血病(GVL)效应。我们从1993年6月开始应用活化骨髓和LAK细胞体外双重净化自体骨髓移植(ABMT)和移植后应用低剂量IL-2和LAK细胞治疗白血病,10例白血病接受该方案治疗,其中急性非淋巴性白血病6例、淋巴瘤性白血病和慢性粒细胞性白血病经化疗和干扰素治疗未达CR者分别为3例和1例。结果表明:①3例对化疗和干扰素治疗无效的病人移植后CR;②10例病人除1例淋巴瘤性白血病病人移植CR10个月复发外,其余病人移植后持续CR为25-1个月,中位数为14个月;③活化骨髓和LAK细胞体外双重净化不影响CFU-GM的回收率,移植净化骨髓不影响造血功能重建;④活性骨髓和LAK细胞净化ABMT后机体细胞免疫功能恢复明显快于未净化移植病     

G-CSF基因治疗及配合大剂量化疗对结肠癌小鼠的治疗作用

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)具有明显的促进粒系造血祖细胞分化成熟、有效地提高外周血白细胞数量的作用;体内单独应用还具有抑制肿瘤的生长、抗肿瘤转移的作用。为了探讨G-CSF基因治疗及其配合大剂量化疗后的体内抗肿瘤效果,我们以C-26结肠癌小鼠为模型,研究腹腔内移植成纤维细胞介导的G-CSF基因治疗,rhG-CSF直接注射治疗,以及分别配合化疗后对肿瘤的治疗作用。结果发现,rhG-CSF直接注射疗法可明显抑制早期结肠癌小鼠肿瘤的生长(P<0.01),明显延长早期荷瘤小鼠的存活期;G-CSF基因治疗可明显抑制早期、中期结肠癌小鼠肿瘤生长(P<0.01),明显延长早期、中期结肠癌小鼠的存活期(P<0.01)。配合大剂量化疗后,rhG-CSF注射疗法及G-CSF基因疗法可更明显地抑制结肠癌小鼠肿瘤的生长,更明显延长结肠癌小鼠的存活期。结果表明,G-CSF基因疗法可有效地延长结肠癌小鼠的存活期,配合大剂量化疗能更有效地发挥抗肿瘤作用,提高结肠癌小鼠的存活期;同时表明,G-CSF基因治疗具有比应用rhG-CSF更显著的体内抑制肿瘤的效果。     

EPO基因治疗安全性的初步评价

从逆转录病毒及转基因工程细胞两方面对EPO基因治疗的安全性进行了评价.env基因作为野生型逆转录病毒存在的重要标志,其PCR检测结果表明,转EPO基因工程细胞Myo/EPO及Fib/EPO均未检测到env基因的存在.该两种工程细胞体外连续培养20代,生长特性正常,无恶变倾向;裸鼠体内接种实验也未见肿瘤生成.病理检查结果显示,大鼠及裸鼠的细胞接种部位及各主要器官均无病变.初步表明,以逆转录病毒介导的EPO基因治疗是安全可靠的.     

G-CSP基因治疗对大剂量化疗后结肠癌小鼠中性粒细胞数量和功能的影响

中性粒细胞作为一种重要效应细胞在机体抗肿瘤过程中发挥重要的作用。为了探讨G-CSF基因治疗及大剂量化疗后对荷瘤小鼠中性粒细胞的影响以及G-CSF基因治疗后中性粒细胞在抗肿瘤中所起的作用,我们对G-CSF基因治疗后荷瘤小鼠中性粒细胞的数量和功能进行了研究。结果发现,G-CSF基因治疗与重组G-CSF(rhG-CSF)注射疗法相比,能更明显地提高结肠癌小鼠中性粒细胞的数量、中性粒细胞的吞噬功能、杀伤C-26细胞的活性以及分泌IL-1、TNF、NO水平。对大剂量化疗后的结肠癌小鼠,仍能明显提高中性粒细胞数量、吞噬功能、杀伤C-26结肠癌细胞的活性以及分泌IL-1、TNF、NO水平。表明G-CSF基因治疗比rhG-CSF注射疗法更有效地纠正并提高由于大剂量化疗后引起的外周血中性粒细胞的降低,增强中性粒细胞的杀伤活性,促进中性粒细胞分泌IL-1等细胞因子,发挥直接或间接的抗肿瘤作用。     

人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA,并经核苷酸测序加以证实。将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2,体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10~5CFU/ml。NIH3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后,分泌IL-2水平达118.2U/ml;PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段,提示重组逆转录病毒载体己整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础。     

HSV-TK基因在膀胱癌的体内转移和GCV的治疗效果

目的：探讨HSV－TK基因在膀胱癌动物体内的合适转移途径，观察HSV－TK／GCV系统的体内治疗效果。方法：在T739同基因鼠膀胱癌皮下肿瘤模型中，以裸质粒DNA瘤内直接注射，脂质体包裹和逆转录病毒介导3种不同方法转移HyTK基因，观察GCV对膀胱癌的治疗效果。结果；脂质体复合物组及逆转录病毒组背部肿瘤生长减慢，抑瘤率分别为54％，68％。动物平均存活时间分别比对照组延长28．81％，44．16％。结论：脂质体，逆转录病毒介导的基因转移是膀胱癌基因治疗的有效手段。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCGl)．以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌，观察不同剂量的质粒(pCGl)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明．注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别，而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后弟15～20天左右表达量最高。平均约91ng／ml。生物学恬性检测结果显示，注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量．     

白细胞介素2基因转染肿瘤细胞体外生物学特性的研究

应用逆转录病毒载体PLXSN将人的IL-2基因和抗新霉素基因(Neo~R)插入人肺腺癌细胞,转染以后,经G418筛选,获得阳性细胞.将转染与未转染细胞作比较,观察了两者在体外的生长特性.测量了阳性细胞上清液中IL-2含量.PCR证实了外源性基因的插入及持续稳定表达.另外在电镜下,可见转染细胞表面绒毛变短变少,此变化是否会影响细胞的浸润性及转移性尚待进一步研究.