腺病毒介导的大肠杆菌CD自杀基因体内外对肿瘤杀伤作用的研究

编委会 Editorial Board名誉主编 Honorary Editor-in-chief吴孟超 Wu Meng chao(Second Military Medical University,Shanghai 200433学术顾问 Academic Advisers巴德年 Ba Denian(Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730)刘新垣 Liu Xinyuan(Shanghai Institute of Biochemistry,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031)吴旻 WuMin(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)汤钊猷 Tang Zhaoyou(Shanghai Medical University,Shanghai 200032)主编 Editor-in-chief张友会 Zhang Youhui(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021)副主编 Associate Editor-in-chief崔正言 Cul Zhenyan(Department of Immunology,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250001)钱振超 Qian Zhenchao(Department of Patho-physiology,Dalian Medical University,Dalian 116027)何球藻 He Qiuzao(Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)董志伟 Dong Zhiwei(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)常务副主编 Managing Editor-in-chief     

体内复制缺陷型腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染胶质瘤细胞对5-氟胞嘧啶敏感

病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细胞才易被转染,且TK基因疗法所产生的旁观者效应需依赖细胞间的直接接触。本文介绍通过复制缺陷的腺病毒载体介导将细菌胞嘧啶脱氨酶(cd)基因转染至大鼠9L胶质瘤细胞,使其对在正常细胞没有毒性的核苷-5-氟胞嘧啶(5-Fc)敏感。     

CD/5－FC体系对人乳腺癌基因治疗作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ／５－ＦＣ体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用ＭＴＴ法测定人乳腺癌细胞对５－ＦＣ的敏感性。结果：实验显示,５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用,而对未导入ＣＤ的人乳腺癌细胞的毒性较低,５－ＦＣ对导入和未导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的ＩＣ５０分别为４１８μｇ／ｍｌ和１２４９μｇ／ｍｌ。结论：ＣＤ／５－ＦＣ体系对体外转基因的人乳腺癌细胞有一定的抗肿瘤作用。     

大肠杆菌CD自杀基因转染诱导肿细胞凋亡及旁观者效应的研究

以重组腺病毒AdCD为载体将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外传染小鼠红白血病细胞FBL3,结果显示,转染了CD基因的FBL3细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性显著提高,进一步研究发现,AdCD/5-FC系统可以诱导肿瘤细胞发生凋亡;将经AdCD/5-FC处理过的FBL3细胞上清倍比稀释后,加入到野生型FBL3细胞中,发现当上清仅占6.25％时,即对野生型FBL3细胞发挥明显的杀伤作用,提示旁观者效应在AdCD介导的细胞毒作用中起着重要的作用。本实验还观察了CD基因体内转染后的杀伤效果,荷瘤小鼠局部注射AdCD并连续10天给予5-FC(300mg/kg)治疗后,小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制。     

胞嘧啶脱氨酶/氟胞嘧啶体系对人乳腺癌基因的实验治疗作用

目的：研究胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）／氟胞嘧啶（５－ＦＣ）体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用ＭＴＴ法测定人乳腺细胞对５－ＦＣ的敏感性。结果：５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用,而对未导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的毒性较低,５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的ＩＣ５０分别为４１８μｇ／ｍｌ和１４２９μｇ／ｍｌ。结论：ＣＤ／４－ＦＣ体系对体外转基因的人乳腺癌细胞具有抗肿瘤作用。     

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的：构建含胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）重组腺病毒（AdE1CMVCD），并鉴定；用自杀基因治疗系统（AdE1CMVCD/5-FC）对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法：体外实验：用不同稀释度的AdE1CMVCD)转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶（5-FC），用MTT法检测OD570nm值，按公式计算细胞生长抑制率；体内实验：建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型，瘤体内导入AdE1CMVCD，腹腔注射5-Fc，观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果：该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加，最大抑制率达61.29％，同时观察到了明显的旁杀伤作用；在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用，明显延长荷瘤小鼠生存期。结论：本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用，为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL—2基因疗法的肿瘤治 …

以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移,研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天,肿瘤局部 注射表达ＩＬ－２的重要腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达的ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续０天给予５－氟胞嘧啶３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。     

肝癌自杀基因治疗研究进展

自杀基因治疗民为肝癌基因治疗研究的热点。本文对近年来有关进展,如自杀基因的毒性作用、影响因素、载体、靶向性及与其它方法的联合应用作一综述。     

融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究

  目的  构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒,体外观察其对人卵巢癌细胞的直接抑制作用及其对血管内皮细胞生长的抑制作用。  方法  用细菌内同源重组方法构建腺病毒穿梭质粒prAdCDglyES。采用脂质体介导转染293包装细胞,扩增获取重组腺病毒rAdCDglyES。采用MTT法观察rAdCDglyES对卵巢癌细胞SKOV-3生长抑制的影响,同时观察其表达产物抑制脐静脉血管内皮细胞ECV-304增殖的作用。  结果  纯化的rAdCDglyES滴度是1×1013.3 TCID50/L,其对SKOV-3细胞生长抑制率是（83.1±6.3）%,与对照组rAd-LacZ（24.1±13.2）%相比有显著性差异（P < 0.01）。浓缩的转染rAdCDglyES的细胞培养上清液抑制ECV-304细胞增殖,抑制率是（78.7±1.6）%,而同样浓缩的转染rAd-CD的细胞培养上清液抑制率是（23.9±9.7）%,二者有显著性差异（P < 0.01）。  结论  研究结果表明重组腺病毒rAdCDglyES具有体外直接和间接抑制人卵巢癌细胞效能。      

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的　建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法　采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果　重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论　本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。     

p16基因重组质粒的构建及其对人肺癌细胞的抑制作用

表达大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因的重组腺病毒AdCD体外转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10,结果显示转染了CD基因的B16F10细胞对5-氟胞嘧啶(5FC)的敏感性显著提高.将经AdCD/5FC系统处理的B16F10细胞上清倍比稀释后.加至野生型B16F10细胞中,发现当上清仅占6.25%时即可对野生型B16F10细胞发挥明显的杀伤作用,提示AdCD/5FC介导的旁观者效应可能是通过5FC经CD酶代谢产生的毒性产物扩散而实现的.本实验还观察了CD基因体内转染后的杀伤效果,荷瘤小鼠经注射AdCD并连续10天给予5FC治疗后,与PBS、对照病毒AdLacZ/5FC治疗小鼠比较,小鼠肿瘤生长明显受到抑制,小鼠存活期明显延长.     

腺病毒介导的肿瘤血管靶向的体外自杀基因治疗研究

本工作在血管内皮细胞中分别建立了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统,用于抑制实体肿瘤中血管生成的研究.构建含自杀基因的重组腺病毒AdCMVtk和AdCMVcd,滴度均1×10~(12)pfu/ml.病毒感染小鼠血管内皮细胞lGll(MOI=100),并鉴定自杀基因的表达,测定原药对它们的杀伤.生长抑制试验表明,GCV对lGll/Ad-tk细胞杀伤的IG_(50)为0.2μmol/ L,5-FC对lGll/Ad-cd细胞杀伤的IC_(50)为20μmol/L.电镜下显示被原药杀伤的血管内皮细胞有明显的细胞凋亡现象.同时混合细胞实验证明两系统均存在明显的旁杀伤效应.从而在体外水平证明了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统杀伤增生血管内皮细胞的有效性.     

癌胚抗原启动子控制胞嘧啶脱氨酶基因体外对结肠癌细胞专一性杀伤

目的：研究癌胚抗原（CEA）启动子是否能控制大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC－CD）基因在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤结肠癌细胞。方法：构建由CEA启动子驱动的含EC－CD基因的重组腺病毒载体AdCEACD与由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的含EC－CD基因的腺病毒载体AdCMVCD，分别感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo细胞和CEA阴性的Hela细胞，用RT－PCR法检测受染细胞中EC－CD基因的表达，并用MTT法检测感染后细胞对5－氟胞嘧啶（5－FC）的敏感性。结果：Lovo细胞在AdCMVCD与AdCEACD感染后均有EC－CDmRNA表达，且对5－FC的敏感性明显增强，Hela细胞在AdCMVCD感染后有EC－CDmRNA表达，对5－FC的敏感性增强，而在AdCEACD感染后则没有EC－CDmRNA表达，5－FC对其亦无杀伤作用。结论：CEA启动子能够控制EC－CD基因专一性地在CEA阳性的结肠癌细胞中表达，从而实现EC－CD基因的靶向性作用。     

hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3 Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1 CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5 FC对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体,转染pcDNA3.1 CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERT CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5 FC敏感;而转染hTERT CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5 FC不敏感。结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5 FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。     

自杀基因在肺癌中的研究进展

全文从自杀基因治疗体系的构成、作用机制、旁观者效应、与其他治疗联合应用、提高自杀基因转导效率及其在肺癌中的研究进展进行综述.     

胞嘧啶脱氨酶基因旁观者效应与宿主免疫状态关系

目的 :研究胞嘧啶脱氨酶自杀基因 (E .Coli.cytosingedeaminasegene ,EC CD)旁观者效应与宿主免疫状态的关系。方法 :CT2 6细胞分别接种于Balb/c小鼠及Balb/cnu/nu裸鼠皮下 ,每只动物接种相互分离的两处 ,在其中一处瘤体内接种AdCMVCD ,腹腔给予氟胞嘧啶 (5 fluorocytosine ,5 FC) ,观察肿瘤体积的变化。并用FCM检测肿瘤浸润淋巴细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。结果 :Balb/c小鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 95 2± 898 6 5mm3 ,其对侧为 2 5 74 8± 339 0 5mm3 ,均明显小于对照组 (P =0 0 0 9,P =0 0 12 )。Balb/cnu/nu裸鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 32 6± 36 8 5 3mm3 ,明显小于对照组(P =0 0 15 ) ,而其对侧为 396 0 9± 12 80 76mm3 ,明显大于治疗组接种侧 (P =0 0 4 9) ,但与对照组两侧间均无差异。FCM显示Balb/cnu/nu裸鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞主要是CD3+、CD4 +的淋巴细胞 ,而Balb/c小鼠体内肿瘤主要是CD3+、CD8+的淋巴细胞。结论 :EC CD/ 5 FC系统的旁观者效应特别是远距离旁观者效应与宿主免疫状况有关 ,在免疫健全宿主中旁观者效应较强。     

CD基因对人胰腺癌细胞株Patu 8988杀伤作用的研究

目的　探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶 (CD )基因对人胰腺癌细胞株Patu 8988的杀伤作用。方法　采用细菌内同源重组方法 ,构建含胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因重组腺病毒载体 ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的重组腺病毒 ,体外转染人胰腺癌细胞株Patu 8988,并给予前药 5 Fc ,观察其体外杀伤效果。结果　含CD基因的腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml ,将重组腺病毒转染胰腺癌细胞株Patu 8988,加用前药 5 Fc后 ,转染CD基因的Patu 8988细胞及混育的胰腺癌细胞生长明显受抑制。结论　CD腺病毒不仅转染效果强 ,而且可直接或通过旁观者效应杀伤胰腺癌细胞。自杀基因治疗有可能成为治疗胰腺癌的有效方法