~(60)Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞的增殖及TNF-α分泌的影响

 目的　用⁶⁰ 钴 (⁶⁰ Co)照射肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞 (BEL 74 0 4 TNF细胞 ) ,用于制备一种肿瘤疫苗。方法　用不同方式及不同剂量的⁶⁰ Co照射BEL 74 0 TNF细胞及未转基因的BEL 74 0 4细胞 ,观察照射后细胞增殖情况及肿瘤坏死因子α(TNF α)分泌量。结果　经 80Gy ⁶⁰ Co连续分量照射的BEL 74 0 TNF细胞增殖能力丧失 ,但仍然生存并能持续分泌TNF α2周以上 ,细胞在 3周内全部死亡。结论　用⁶⁰Co照射BEL 74 0 4 TNF细胞制备肿瘤疫苗是可行的 ,80Gy ⁶⁰Co连续分量照射可能是合适剂量     

60Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞的增殖及TNF-α分泌的影响

目的用60钴(60Co)照射肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞(BEL-7404-TNF细胞),用于制备一种肿瘤疫苗.方法用不同方式及不同剂量的60Co照射BEL-740-TNF细胞及未转基因的BEL-7404细胞,观察照射后细胞增殖情况及肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌量.结果经80Gy60Co连续分量照射的BEL-740-TNF细胞增殖能力丧失,但仍然生存并能持续分泌TNF-α2周以上,细胞在3周内全部死亡.结论用60Co照射BEL-7404-TNF细胞制备肿瘤疫苗是可行的, 80Gy60Co连续分量照射可能是合适剂量.     

不同种类细胞培养和冻存方法的改进

目的 探讨不同细胞冻存与培养条件对保存肿瘤细胞株的影响。方法 快速冻存法、慢速冻存法,结果 (1)10％FCSRPMI1640培养基即可满足小鼠肝癌细胞株Hep—A—22细胞的培养基要求,而人肝癌细胞株QGY—7703细胞对RPMI1640培养基的要求较高,我们摸索需要15％—20％的FCS RPMI1640培养基方能满足其要求。(2)采用快速冻存法有利于肿瘤细胞株的复苏。结论 不同种类肿瘤细胞株由于其增殖能力不同所使用培养基所含成份应有所区别:快速冻存方法对肿瘤的细胞株保存优于传统的慢速冻存法。     

^60Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞增殖的影响

用肿瘤疫苗增强机体抗肿瘤免疫反应是预防和治疗肿瘤的重要途径之一。我们采用不同照射方式及不同剂量的~(60)Co照射人TNF-α基因转导的人肝癌细胞(BEL-7404-TNF),观察其增殖及TNF的分泌量,以便选择合适的细胞作为肝癌疫苗进行动物实验。     

体外培养不同时间后冻存对脐血来源CIK细胞生物学活性的影响

目的： 观察体外培养不同时间后冻存对人脐血来源细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖、免疫表型、细胞毒活性以及细胞因子分泌的影响。 方法： CIK细胞在体外培养6 、9 、12 d后冻存1个月,复苏后培养至72 h,其间每隔24 h检测细胞增殖情况,并采用流式细胞术检测复苏后细胞免疫表型、CCK-8法检测复苏后细胞对A549细胞的杀伤活性、ELISA方法检测复苏后CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的变化。 结果： 体外培养不同时间后冻存的CIK细胞在复苏后仍然显示出较好的增殖活性,其中,体外培养6 d后冻存组CIK细胞增殖活性明显高于体外培养9 d和12 d后冻存组CIK细胞,复苏72 h时,6、9、12 d冻存组CIK细胞数分别为(35.90±1.67)×106、(18.98±2.13)×106和(11.76±2.12)×106个（P<0.01）。 体外培养6、9、12 d后冻存组CIK细胞复苏24 h后,各冻存组CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞比例逐渐增加,且复苏72 h后6 d冻存组CIK细胞中CD3+CD56+和CD3+CD8+细胞比例最低。体外培养后冻存组CIK细胞在复苏24 h内对A549细胞的杀伤活性较低,但24 h后细胞毒活性有较大幅度的增加,且体外培养12 d后冻存组CIK细胞对A549细胞的杀伤活性高于6 d和9 d冻存组CIK细胞,如复苏后72 h,12、6、9 d冻存组CIK细胞对A549细胞的抑瘤率分别为（0.81±009）%、（0.59±0.06）%、（0.42±0.08）%（P<0.01）。ELISA检测结果显示,随着复苏时间的延长,体外培养不同时间后冻存的CIK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平也逐渐上升;复苏72 h时,体外培养6 d后冻存组CIK细胞分泌IFN-γ的量要高于其他组,而体外培养12 d后冻存组TNF-α的分泌量则明显高于其他组。 结论： 体外培养不同时间后冻存对CIK细胞的生物学活性有一定影响,但复苏后经短时间培养后基本恢复,提示CIK细胞可以在培养至12 d后进行冻存。     

ERCC1在鼻咽癌组织中的表达及其与顺铂化疗敏感性的关系

目的: 用自制的改良细胞冻存液冻存树突状细胞（dendritic cells,DCs）,观察冻存复苏后DCs的细胞存活率及体外诱导CIK(cytokine induced killer cell)对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：从外周血分离、培养获得DCs,分别用3种冻存液冻存:（1）含10%二甲基亚砜(DMSO)、20%牛血清的RPMI 1640培养液;（2）日本ZENOAQ公司的Cellbanker细胞冻存液;（3）自制细胞冻存液（含DMSO、羟乙基淀粉及细胞稳定剂）。每组DCs分6管,于-80 ℃和-196 ℃各冻存3管,分别于冻存后第30、60和180 d复苏,用锥虫蓝染色法测定细胞存活率,用MTT法检测冻存复苏后DCs活化的CIK对K562细胞的杀伤活性。结果：每组3种冻存液冻存的DCs随着冻存时间的延长,冻存复苏DCs的存活率和活性均有轻度下降,但经统计学分析3种冻存液的冻存效果无明显差别。结论：自制的改良细胞冻存液能够替代传统冻存液和进口冻存液用于DCs的冻存,有良好的推广前景     

体外培养人肺腺癌细胞液氮冻存及复苏培养

将离体细胞在实验室中进行长期培养,建立体外实验模型的组织培养技术,已广泛应用于基础医学科学的研究。培养细胞的保种则是细胞株/系建立后的一个重要问题。组织培养中常用传代培养法和低温冻存法。比较而言,前者不仅耗费了大量人力、物力、而且难以避免微生物污染等意外,甚至发生细胞生物学特征的改变。为此,我们对几个细胞系进行液氮低温(—196℃)冻存。现将液氮中成功冻存4年的高转移性人肺腺癌 Anip—973细胞系的冻存及复苏培养情况简介如下。     

体外培养人体肝癌细胞液氮冻存7年及复苏培养

本文报告了体外培养的人体肝癌细胞系(QGY-7703)冻存于液氮。7年后复苏培养成功,分析细胞形态、增殖速度、有丝分裂和染色体计数等生物学特征无显著改变。因而证明,液氮冻存法是培养细胞长期保种的一个行之有效的方法。成败的重要因素在于选择好冻存用细胞,并掌握好冻存时缓慢降温和复苏时急速融化的速度。     

分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性与稳定性的研究

 目的　研究在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性、稳定性及抗体产量。方法　利用人IgG和鼠IgG作为浓度标准 ,绘制浓度曲线 ,比较研究转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。腹腔接种转染瘤细胞诱导裸鼠产生腹水抗体 ,经离子交换法纯化 ,电泳鉴定纯化嵌合抗体。结果　 1× 10 ⁵个 5ml转染瘤细胞培养 5天的上清中 ,嵌合抗体分泌量为 (0 .5～ 5 ) μg ml。Balb c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 (3～ 5 )ml,腹水抗体经纯化 ,抗体产量约为 (1～ 2 )mg (ml腹水 )。经离子交换法纯化 ,电泳鉴定 ,在分子量 5 5kDa和 2 5kDa处 ,可见有抗体IgG蛋白质的重链和轻链的染色条带。结论　由我们制备的在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,产量高 ,特异性强。     

MUC1的表达与乳腺癌细胞粘附的关系

背景与目的:近年研究认为,肿瘤的转移与肿瘤细胞膜上粘液型糖蛋白的大量形成有关。本实验研究糖基化抑制剂苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺对粘蛋白-1(mucin1,MUC1)形成的抑制作用及其对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的粘附、侵袭转移能力的影响。方法:免疫细胞化学法检测MUC1表达,噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞对人工基底膜(Matrigel)的粘附能力,明胶酶谱法(zymography)检测MDA-MB-231细胞MMP-2、MMP-9的分泌变化。结果:经苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺去糖基化处理后的肿瘤细胞组与相应对照组比较,MUC1表达降低,对基底膜的粘附力明显降低(P<0.01),同时细胞中MMP-2和MMP-9的分泌量显著下降。结论:MUC1表达水平与肿瘤细胞的粘附能力相关,MUC1的抑制使乳腺癌MDA-MB-231细胞粘附能力,分泌Ⅳ型胶原酶能力明显减弱。     

外周血干细胞冻存的探讨

目的　对冻存外周血干细胞所用的冻存液配方 ,冻存温度 ,存放时间等作一探讨。方法　用血细胞分离机采集经化疗药物及G CSF联合动员的肿瘤患者外周血干细胞 ,用 10 %DMSO 自体血浆或 5 %DMSO 6%HES 4%人血清白蛋白作冷冻保护剂 ,分别于液氮中和 -80℃低温冰箱中冻存 ,不同时间复苏 ,检测细胞活性 ,CD3 4阳性比率 ,及CFU GM数 ,分析冻存效果。结果　冻存半年 ,液氮和 -80℃对于干细胞的冻存无明显影响 ,用 10 %DMSO 自体血浆作冻存剂 ,于 -80℃低温冰箱保存的细胞 ,活力达 ( 95 .7 /-5 .84) % ,单个核细胞回收率 ( 92 .2 5 /-9.3 2 ) % ,CD3 4阳性细胞回收率 ( 71.73 /-2 7.0 3 ) % ,CFU -GM回收率 ( 77.89 /-12 .3 1) %。 9例患者行自体外周血干细胞移植 ,平均CD3 4阳性细胞回输量为每公斤体重 1.46× 10 7,CFU GM为每公斤体重 3 .85× 10 5,回输后患者平均 17天恢复中性粒细胞 2 .0 g·l-1以上 ,恢复血小板 5 0 g·l-1以上。结论　应用经 -80℃低温冻存的 10 %DMSO 自体血浆冻存外周血干细胞进行自体移植是简单可行的。     

应用TNF基因转染细胞进行的肿瘤实验性免疫疗法

基因修饰的肿瘤细胞所分泌的TNF(肿瘤坏死因子)能够主要通过诱导机体的抗肿瘤免疫反应而使机体产生强大的抗肿瘤免疫功能，这一效应的发挥需要肿瘤局部TNF的持续的存在并具有剂量依赖性，同时不应伴有全身性毒副作用，在体内，分泌TNF的肿瘤细胞局部浸润的细胞主要是巨噬细胞及CD4^ 和CD8^ T淋巴细胞，巾于在有效的抗肿瘤免疫反应中必需巨噬细胞及CD8^ T细胞的参与．CD4^ T细胞似为无辜旁观者细胞。肿瘤细胞所分泌的TNF在T细胞缺陷鼠中也有一定作用，但大多数资料表明T细胞对于肿瘤细胞的完全清除是必需的。根据所选择的肿瘤细胞类型及转染细胞所分泌的TNF水平．TNF所引起的实验动物全身性毒副作用包括恶液质及消瘦，部分体内实验结果表明．TNF基因转染的肿瘤细胞不仅不能抑制肿瘤细胞的生长．反而会促进肿瘤的转移。将TNF基因转染的肿瘤细胞制备的瘤苗也不能使机体对亲本肿瘤的侵袭产生保护性免疫反应。     

肿瘤生物治疗新方法的研究

本文简述“九五”攻关项目间“肿瘤生物治疗新方法”且经协作攻关主要完成的研究工作有：重组人TNF、IL－2及B7重组腺病毒表达载体的构建及其包装体系的建立：腺病毒介导的人TNF－α基因转染对人肝癌细胞凋亡和MHC－Ⅰ类分子表达的影响;瘤体内／瘤周注射TNF－α重组腺病毒和（或）IL－2T重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用及其免疫机理研究。粘附LAK细胞的制备、体外扩增、冻存及复苏;转染B7、IL－2、TNF－α基因重组腺病毒的肿瘤细胞及A－LAK的生物学特性研究;人肝癌组织中MAG基因的表达及MAGE基因修饰树突状细胞体外抗肿瘤作用;转基因瘤苗临床应用安全性的初步性的初步检测,这些研究工作的完成为肿瘤基因治疗的临床应用打下基础。     

γ-干扰素基因修饰人肝癌细胞的体外生物学行为

目的　研究γ干扰素(IFNγ)基因修饰人肝癌细胞的某些体外生物学行为。　方法　用逆转录病毒载体建立4种γ干扰素基因修饰人肝癌细胞,分别检测外源基因表达、细胞形态结构、体外生长速率及60Co照射的影响。　结果　4种IFNγ基因修饰人肝癌细胞表达不同生物活性水平的IFNγ,体外生长速率有不同程度的下降。经60Co照射及冻存处理,复苏后仍能分泌较高水平的IFNγ。　结论　IFNγ基因修饰人肝癌细胞体外生物学行为有一定程度的变化,为瘤苗的临床应用提供了一定依据     

转人TNFα基因对肾细胞癌细胞致瘤性的影响

目的:观察转人TNFα基因对肾细胞癌细胞(RCC) 致瘤性的影响,为进一步对RCC 的基因治疗打下基础。方法:将人TNFα基因构建入逆转录病毒载体,经包装、鉴定后,感染RCC 细胞株78620 , EL ISA 法测转人TNFα基因78620 细胞上清中TNFα的活性,同时,将转人TNFα基因的78620 细胞接种裸鼠,观测转TNFα前后RCC 细胞致瘤性的变化。结果: 转人TNFα78620 细胞上清TNFα的浓度平均为(5 004 ±624) pg/ ml ,接种裸鼠后无肿瘤长出。结论:转人TNFα基因使建株RCC 失去了致瘤性。     

不同照射剂量对脐血贴壁层细胞功能的影响

目的了解不同剂量照射后,脐血贴壁层细胞的吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF)表达水平的变化.方法不同剂量60Co照射脐血贴壁层细胞,采用酶联法测定其吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF)表达.结果脐血贴壁层细胞在接受7.5 Gy 60Co照射后其吞噬功能最强,而肿瘤坏死因子(TNF)表达水平则在接受2.5 Gy～5.0 Gy 60Co照射时达高峰.结论脐血贴壁层细胞对照射抵抗力较强,可促进放疗患者机能恢复.     

钩吻碱注射液对肿瘤细胞增殖能力的影响

本研究采用体外细胞实验模型,细胞生物学方法,观察钩吻碱注射液(Ge)对肿瘤细胞增殖能力及辐射敏感性的影响。结果表明:Ge对肿瘤细胞具有一定的毒性作用,对其增殖能力有一定的抑制作用,如增长速度减慢,有丝分裂指数下降,细胞死亡率明显增高。Ge似可提高肿瘤细胞膜脂微粘度,使其流动性降低;还能提高肿瘤细胞对~(60)Coγ射线的辐射敏感性,使辐射增敏比(SER)增加,提示Ge可作为辐射增敏剂与放射治疗相结合用于治疗肿瘤。     

细胞因子和低氧对胰腺癌细胞表达血管内皮生长因子A、C的调节

目的:探讨细胞因子白细胞介素(IL)-1α、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)α、SNAP(S-nitroso-nacetyl-penicillamine)(在培养细胞中可释放NO,使细胞处于低氧状态)对胰腺癌细胞产生和分泌血管内皮生长因子(VEGF)-A、C的调节。方法:用northernblot和westernblot法分别分析人胰腺癌细胞株中VEGF-A、VEGF-C基因和蛋白的表达;以IL-1α(10μg/L)、IL-6(100μg/L)、TNFα(50μg/L)或SNAP(25mg/L)刺激细胞株后用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)分析其VEGF-A、VEGF-C基因的表达。结果:Northernblot法显示6种胰腺癌细胞株均有4.1kbVEGF-A基因和2.4kbVEGF-C基因的表达;Westernblot法显示这6种胰腺癌细胞株均有相对分子质量为43×103的VEGF-A蛋白和相对分子质量为55×103的VEGF-C蛋白表达。RT-PCR分析法显示:IL-1α使细胞株COLO-357产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别增加1~2倍、1倍;IL-6刺激细胞株CAPAN-1产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别增加2~5倍、1倍;TNF-α使细胞株COLO-357产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别减少1~2.5倍、1~2倍,使细胞株CAPAN-1产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别减少1倍、1.6~2.5倍;而SNAP刺激细胞株COLO-357产生VEGF-AmRNA增加5倍,刺激细胞株CAPAN-1产生VEGF-AmRNA增加4倍。结论:细胞因子IL-1α、IL-6、TNFα和SNAP通过调节血管内皮生长因子A、C的表达而影响胰腺癌细胞的生物学特性。     

转入TNFα基因对肾细胞癌细胞致瘤性的影响

目的 :观察转人TNFα基因对肾细胞癌细胞 (RCC)致瘤性的影响 ,为进一步对RCC的基因治疗打下基础。 方法 :将人TNFα基因构建入逆转录病毒载体 ,经包装、鉴定后 ,感染RCC细胞株 786 0 ,ELISA法测转人TNFα基因 786 0细胞上清中TNFα的活性 ,同时 ,将转人TNFα基因的 786 0细胞接种裸鼠 ,观测转TNFα前后RCC细胞致瘤性的变化。结果 :转人TNFα786 0细胞上清TNFα的浓度平均为 (5 0 0 4± 6 2 4) pg/ml,接种裸鼠后无肿瘤长出。结论 :转人TNFα基因使建株RCC失去了致瘤性。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转染的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察

以逆转录病毒为载体将小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)基因转染人小鼠黑色素瘤细胞(B16)中,经G418抗性筛选,有限稀释及培养上清中TNF活性测定,从多株阳性克隆中筛选到一株高分泌TNF的克隆株(B16-TNF_a~( )).B16-TNF_a~( )细胞的形态,体外增殖能力及集落形成能力与野生型B16细胞无显著差异.体内致瘤性实验表明,B16-TNF_a~( )细胞致瘤性下降,但致瘤性高低与接种细胞数量有关.小鼠皮下接种1.25×10~4或更多细胞,肿瘤结节形成率与接种细胞数量成负相关;而接种6.25×10~3细胞的小鼠肿瘤结节形成率反而高于2.5×10~4细胞接种的小鼠.接种B16-TNF_a~( )的荷瘤小鼠长期存活率显著高于对照组.本实验为进行肿瘤细胞靶向的TNF基因治疗奠定了实验基础.