TNF—α基因转染对胃癌细胞系的生长抑制效应

本工作以逆转录病毒为载体将TNF-α基因导入胃癌细胞系MKN28和BGC823,经筛选获阳性克隆MKN28-TNF和BCC823-TNF.对TNF基因在肿瘤细胞中的表达及其对肿瘤细胞的作用进行了探讨.证明外源TNF基因在肿瘤细胞中获得表达;肿瘤细胞生长速度明显减慢,生长抑制率分别达71%和 66%.HTdR掺入率在TNF基因转染细胞明显降低.转染后的肿瘤细胞丧失了裸鼠体内成瘤能力.实验结果表明TNF基因导入胃癌细胞后,细胞生长及致癌能力受到明显抑制,为TNF最终能用于临床胃癌基因治疗提供了有意义的资料.     

E2F-1基因过表达影响胃癌MGC-803细胞对化疗药物敏感性的研究

目的:构建E2F-1真核表达载体,建立稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株,探讨E2F-1基因过表达对胃癌MGC-803细胞化疗敏感性的影响.方法:应用Trizoi法从胃癌的癌组织中提取mRNA逆转录合成cDNA,按Gene-Bank公布的E2F-1基因序列设计带有酶切位点的引物并行扩增获得E2F一1的ORF片段;然后经限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选.用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株.实时定量PCR(real-timequantitative PCR)和蛋白印迹(Western blotting)技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况.四唑蓝(MTT)法检测MGC-803/E2F-1组(实验组)、MGC-803/EV组(阴性对照组)和MGC-803组(未转染组)细胞对化疗药物的敏感性.结果:重组载体pCMV-E2F-1-HA2经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切后得到预期片段,测序结果与报道的E2F-1基因之ORF完全一致.证明目的基因已成功克隆入真核表达载体,获取具Genectin抗性的细胞克隆,并进行了扩增.RT-PCR和Westernblotting实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1.MTT法检测发现,5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)对MGC-803/E2F-1组细胞的抑制率分别为71.45%、74.03%、76.72%,均明显高于MGC-803/EV组(45.58%、53.69%、54.58%)和MGC-803组(53.70%、54.67%、55.05%)(P<0.05).结论:成功构建了真核表达载体pCMV-E2F-1-HA2,并建立了稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株MGC-803/E2F-1.E2F-1过表达增强了胃癌细胞对化疗药物的敏感性.     

E2F-1基因反转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞MGC-803增殖的影响

目的:通过构建人同源基因E2F-1反转录病毒表达载体,观察E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖的影响.方法:应用基因重组技术将E2F-1基因克隆到反转录病毒载体pLXSN中,并将经酶切和RT-PCR检测正确的重组载体转染PA317包装细胞,收集病毒上清液感染胃癌细胞MGC-803.应用 RT-PCR和Western印迹法检测MGC-803/pLXSN-E2F-1细胞中E2F-1 mRNA和蛋白的表达情况.应用克隆形成实验和MTT法检测细胞的增殖情况.结果:经酶切和RT-PCR检测结果显示,成功构建E2F-1反转录病毒表达载体.与MGC-803和MGC-803/pLXSN组相比, MGC-803/pLXSN-E2F-1组E2F-1 mRNA和蛋白的表达明显上调(P<0.05).MGC-803/pLXSN-E2F-1组的克隆形成率为48%,明显低于MGC-803组的81%和MGC-803/pLXSN组的77%,差异有统计学意义(P<0.01).MGC-803/pLXSN-E2F-1组的细胞增殖率明显慢于MGC-803组和MGC-803/pLXSN组(P<0.01).结论:成功构建了E2F-1基因过表达的反转录病毒表达载体,并将其成功感染MGC-803细胞,E2F-1过表达可抑制MGC-803细胞的增殖.     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

AIF基因真核表达载体的构建及其在MGC-803中的表达

[目的]检测胃癌标本中AIF基因是否存在碱基突变;构建AIF基因真核表达载体AIF—GFP;并检测其在胃腺癌细胞株MGC-803中的表达。[方法]应用RT—PCR的方法分别从5例胃癌组织标本中提取总RNA,进一步扩增出全长的AIF基因;将其克隆到DMD19-T载体进行测序,并亚克隆至真核表达载体pEGFP—N2,重组载体AIF—GFP采用脂质体法瞬时转染MGC-803细胞,荧光显微镜观察AIF—GFP在细胞中的表达：[结果]由5例胃癌组织标本提取的mRNA所扩增出的AIF基因的序列与GeneBank中AIF（AF100928）序列完全一致．胃癌组织中均未发现碱基突变;构建了真核表达载体AIF—GFP;并将其转染MGC-803进行表达。[结论]胃癌中AIF基因未发生碱基突变;AIF-GFP真核表达载体,在MGC-803细胞中获得了表达,为进一步探讨AIF在胃癌诊治中的应用奠定了基础。     

特异性沉默Eca109 细胞系stat hmin 基因siRNA 表达载体的构建

 目的 构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法 用DNA重组技术,将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER-EGFP,应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPER-S转染细胞系Eca109,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,RT-PCR检测转染细胞stathminmR-NA的表达。结果 重组逆转录病毒载体经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,可见4692nt和285nt条带;测序结果表明插入序列正确;重组载体转染Eca109细胞,可表达绿色荧光蛋白（EGFP）,经G418筛选得到抗性细胞克隆,转染细胞stathmin mRNA的表达较对照组明显减弱。结论 特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。     

膜结合型TNF-α基因在人胃癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

TNF-α是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子．它有二种形式，一种是26kD膜结合型，另一种是17kD分泌型，二者在体外均有细胞毒活性。我们利用逆转录病毒载体LXSN构建了插入突变的膜结合型TNF-α基因的重组逆转录病毒载体。用Lipofectin将逆转录病毒载体及重组逆转录病毒载体引入包装细胞CRIP，     

利用GFP逆转录病毒标记肿瘤与血管内皮细胞

目的 制备携带GFP基因的逆转录病毒,以简便、快速标记活细胞。方法 将编码GFP的cDNA片段插入逆转录病毒载体pLNCX构建重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP,借助脂质体转染单嗜性及双嗜性逆转录病毒包装细胞,G418筛选抗性克隆,然后利用荧光显微镜选出GFP表达最高的克隆。取含有毒颗粒的上清液感染NIH3T3及多种肿瘤或血管内皮细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染包装细胞后,包装细胞可表达GFP并产生GFP逆转录病毒。尽管GFP逆转录病毒对动物及人的肿瘤细胞或血管内皮细胞的感染能力各不相同,但由于逆转录病毒能整合进入宿主细胞基因组DNA内,经短期G418筛选后容易获得持续、稳定、高水平表达GFP的阳性细胞。表达GFP的肿瘤细胞仍可在同系动物体内生长并持续表达GFP。携带GFP基因的逆转录病毒能简便、快速介导稳定的基因转移,遗传标记多种细胞,比表达质粒等更优越。     

靶向EBV潜伏期基因EBNA2小干涉RNA系统的构建

[目的]构建携带靶向EBV核抗原EBNA2(EBV nuclear antigen,EBNA)的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体,进而筛选出稳定产毒的细胞克隆。[方法]用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(smallhairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列定向插入逆转录病毒载体pSUPER.retro,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PheonixA,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。[结果]重组逆转病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7167bp和281bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染的包装细胞经G418筛选获得能产生逆转录病毒的抗性细胞克隆,病毒滴度为2.5×104CFU/ml。[结论]成功构建和筛选出靶向EBV潜伏期基因EBNA2的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为深入探讨EBNA2基因的细胞转化和抗凋亡作用提供了实验基础。     

外源性TNF基因对人肝癌细胞生长的影响

采用比利时Gent大学的质粒PATHNF(内含人TNF-α-cDNA),以及英国伦敦大学的重组逆转录病毒载体pRUFneo.将人TNF基因克隆到重组逆转录病毒载体pRUFneo,构建了含人TNFL-a基因重组逆转录病毒载体RUF-TNF.将RUF-TNF转染包装细胞FlyA13,经G41筛选获得稳定分泌含人TNF基因重组逆转录病毒的细胞株FlyRUFN14.FlyRUFN14产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Saos-2.采用这一基因转移系统,将TNF基因转染到两株人肝癌细胞株SMMG-7721及BEL-7404,获得转基因肝癌细胞SMMC-7721 TNF及BEL-7404TNF.TNF基因对人肝癌细胞生长的影响采用细胞学实验及裸鼠实验两种方法进行研究.①细胞学实验:将转基因肝癌细胞SMMC-7721TNF及BEL-7404TNF作为实验组,原来的未转基因肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7404作为对照组,用MTT法研究两组的生长速度.结果:转基因肝癌细胞SMMG-7721TNF及BEL-7404TNF的生长速度明显慢于未转基因肝癌细胞,差别有显著意义(P<0.01).②裸鼠实验:     

利用人的天然抗体抗肿瘤

目的构建含D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因的重组逆转录病毒载体,初步观察DAAO基因的功能。方法利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体（pLDAAOSN）中,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,将重组逆转录病毒感染K562白血病细胞,G418筛选出抗性克隆,命名为K     

一株对LAK细胞杀伤耐受的胃癌细胞株的建立及其相关生物学特性的研究

人胃癌细胞系MGC-803经反复与LAK细胞共培养获得对LAK细胞杀伤耐受的特性。在反复共培养十个周期后，残留细胞数量逐渐增多并达到稳定。在八小时^3H-TdR释放细胞毒实验中，当效靶比为40：1时，LAK细胞对亲代细胞MGC-803^p杀伤率为90%，而对耐受株MGC-803^R的杀伤率仅为40%。     

抗癌生物活性肽-S对胃癌细胞周期和凋亡的影响

目的 探讨抗癌生物活性肽-S(ACBP-s)对人胃癌细胞MGC-803细胞周期和凋亡的影响.方法 (1)体外实验:以不同浓度ACBP-S处理人胃癌MGC-803细胞,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定增殖抑制率;电镜下观察细胞凋亡现象;流式细胞术分析细胞周期与凋亡率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测p27基因mRNA和蛋白表达的变化.(2)动物体内实验:建立裸鼠胃癌移植瘤模型,每只裸鼠经尾静脉注射7μg ACBP-S,隔日给药,2周后处死,计算抑瘤率;HE染色观察肿瘤细胞形态变化;免疫组化法检测Bcl-2、Bax和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 (1)5.0、10.0和15.0μg/ml的ACBP-S均能抑制MGC-803细胞的生长,且随浓度增加和作用时间延长抑瘤率增加.电镜下可见,MGC-803细胞经15.0μg/ml ACBP-S作用48h后,呈现典型的凋亡特征.流式细胞术分析结果显示,5.0和20.0μg/ml ACBP-S作用MGC-803细胞24h的凋亡率较高,分别为(5.7±0.2)%和(13.9±0.6)%(P<0.05);20.0μg/ml ACBP-S可使G0/G1期MGC-803细胞的构成比明显上升.ACBP-S上调MGC-803细胞p27基因mRNA和蛋白的表达.(2)ACBP-S能抑制胃癌移植瘤的生长,抑制率达34.2%.镜下可见,治疗组肿瘤组织中出现大片坏死及大量凋亡细胞,异型细胞及核分裂相减少.免疫组化分析结果显示,治疗组Bcl-2和PCNA表达降低,Bax表达增高.结论 ACBP-S能抑制人胃癌MGC-803细胞增殖,其作用机制与调控胃癌细胞的细胞周期和凋亡有关.     

TNF—α基因转染多药耐药性人乳腺癌细胞的基因表达与生物学 …

目的：探索ＴＮＦ－α基因能否成功导入耐药细胞并获得表达,发挥生物学效应。方法：以重组逆转录病毒为载体将ＴＮＦ－α基因导入具有多药耐药（ＭＤＲ）表型的人乳腺癌细胞系ＭＣＦ７／ＡＤＲ,经Ｇ４１８抗生筛选获４株阳性克隆。ＰＣＲ、Ｅｌｉｓａ法鉴定并检测ＴＮＦ－α基因的整合和表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：４株阳性克隆整合了ＴＮＦ－α基因并获得表达,分泌ＴＮＦ－α量     

含人TNF-α基因的重组逆转录病毒载体的构建、包装及对人肝癌细胞的感染

利用逆转录病毒载体LN系列的三种载体LXSN,LNCX和LNSX构建了插入TNF_α基因的重组逆转录病毒载体L-tnfSN,LNC-tnf和LNS-tnf。重组载体用磷酸钙沉淀法引入病毒包装细胞PA317,经G418筛选后,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,结果表明L-tnfSN产生的病毒滴度最高(1×10~5CFU/ml),LNS-tnf次之(5×10~4CFU/ml),LNC-tnf最低(3×10~4CFU/ml)。应用上述三种重组病毒培养液上清,分别感染人肝癌细胞SMMC7721,经G418筛选获得数株抗性克隆。对每种病毒感染的细胞随机挑取6个克隆扩大培养,测定培养液上清中TNFα的分泌量,结果显示L-tnfSN介导感染的克隆中TNFα分泌量最高(382U/10~6细胞/24h),LNC-tnf次之(221u/10~6细胞/24h),LNS-tnF最低(124u/10~6细胞/24h)。反映不同启动子元件有不同的表达强度。     

4-1BB基因在不同分化胃癌细胞株中的表达

目的：研究共刺激因子4-1BB在人胃高分化腺癌细胞株MKN-28、人胃中分化腺癌细胞株SGC-7901、人胃低分化腺癌细胞株BGC-823、人胃粘液腺癌细胞株MGC-803中的表达及其生物学意义。方法：用RT-PCR法测定胃癌细胞株中4-1BB mRNA表达;免疫细胞化学法测定胃癌细胞株中4-1BB蛋白表达;MTT法测定人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性;ELISA法检测人淋巴细胞与胃癌细胞共培养上清液中IL-2、IL-10、TNF-α的含量。结果：RT-PCR结果示4-1BB mRNA表达率从高到低依次为：MGC-803（77.30%）、BGC-823（71.68%）、SGC-7901（40.06%）、MKN-28（37.65%）。免疫细胞化学结果显示4-1BB着色程度由深到浅依次为：MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28。MTT结果显示各时间段（24、48、72h）不同效靶比（10∶1,20∶1,40,∶1）下,人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低的顺序为：MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。ELISA结果显示在各效靶细胞比下,人淋巴细胞与胃癌细胞共培养上清液中IL-2、TNF-α的含量由高到低的顺序均为：MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。而IL-10的含量由高到低的顺序为：MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28。结论：人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803中4-1BB基因的mRNA和蛋白均有表达,且胃癌细胞株的恶性程度越高其4-1BB表达水平越高;淋巴细胞对低表达4-1BB胃癌细胞的杀伤力较高;提示4-1BB可能通过抑制细胞因子TNF-α、IL-2和促进细胞因子IL-10的产生调节肿瘤免疫。     

Cdx2过表达对裸鼠人胃癌移植瘤生长和转移的影响

目的观察Cdx2基因过表达对裸鼠人胃癌移植瘤生长和转移的影响。方法利用脂质体将pCMV-Cdx2-HA质粒或pCMV-HA质粒分别转染人胃癌MGC-803细胞,命名为MGC-803/Cdx2细胞或MGC-803/EV细胞。将两种细胞分别注射入裸鼠近腋右背侧皮下,待皮下成瘤后将瘤组织接种于胃,建立裸鼠人胃癌移植瘤模型：接种MGC-803/Cdx2皮下瘤的裸鼠为实验组,接种MGC-803/EV皮下瘤的裸鼠为对照组;30 d后处死裸鼠,观察移植瘤生长、转移情况,并应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR）和Western blot技术检测移植瘤中Cdx2 mRNA和蛋白的表达。结果实验组肿瘤体积为(13.42±2.34）mm3,明显低于对照组的肿瘤体积(17.59±2.80）mm3(P<0.05）;实验组成瘤率(73.3%）低于对照组成瘤率(86.7%）;两组肿瘤转移情况比较,差异无统计学意义(P>0.05）;实验组肿瘤组织Cdx2 mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05）。结论 Cdx2过表达抑制裸鼠人胃癌移植瘤的生长,但对肿瘤转移无明显影响。     

E2F-1对胃癌细胞侵袭转移影响的观察

目的:探讨E2F-1对人胃癌细胞MGC-803生物学行为的影响。方法:利用脂质体将pCMV-E2F-1-HA质粒和pCMV-HA质粒分别转染人胃癌细胞MGC-803,应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测MGC-803细胞中E2F-1基因的表达;应用体外侵袭实验、迁移实验、细胞基质黏附实验和克隆实验分别检测E2F-1对胃癌细胞MGC-803的侵袭力、迁移力、黏附能力和增殖力的影响。结果:转染pCMV-E2F-1-HA质粒的MGC-803细胞检测到E2F-1的表达;转染pCMV-E2F-1-HA质粒的MGC-803细胞的侵袭力、迁移能力和增殖力较转染pCMV-HA质粒的MGC-803细胞和未转染的MGC-803细胞明显降低(P<0.05),细胞黏附能力未见明显变化,P=0.072。结论:E2F-1高表达对人胃癌细胞MGC-803的生物学特性有较大的影响,具有抑制其侵袭转移的作用。     

导入Rb、p53、p16和H-ras反义RNA对人胃癌细胞恶性增殖的影响

构建Rb、p16、p53、H-ras反义RNA的逆转录病毒载体,利用脂质体介导和病毒感染的方法将其分别转入—存在Rb基因部分缺失、p16低表达、p53缺失和H-ras点突变的胃癌细胞系.观察这些基因对该细胞生长及致癌性的影响,探讨肿瘤相关基因在人胃癌发生、发展过程中的作用.结果表明,通过基因重组技术将多种基因分别重组至逆转录病毒载体PLXSN中,经鉴定获得正插及反插有该基因的重组质粒.将这些质粒分别用脂质体介导和病毒感染的方法转染BGC823细胞,G418筛选2～3周后,获得较高的转染效率.对转染后细胞DNA、RNA进行分析,证明外源性基因已整合人BGC823细胞并获稳定表达.表达有外源性p16、p53基因和H-ras反义RNA的裸鼠致癌性均有明显的抑制作用,而Rb基因对BGC823的恶性增殖能力没有明显抑制.这一结果表明p16、p53、H-ras几个基因的异常可能是导致这一个细胞癌变及最终发展成胃癌的主要原因.本实验进一步明确了胃癌的发生、发展是多基因变异累积的结果.