胎肝造血期胎肝间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

【目的】分离、培养人胎肝造血期胎肝间充质干细胞(MSC) , 研究其生长特性及表面标记的表达。 【方法】取孕16～20 周人胚胎肝脏, 分离培养胎肝MSC, 传代培养成系并检测其增殖能力, 应用流式细胞术、免 疫荧光方法检测其造血相关表面标记和细胞蛋白表达。【结果】人胎肝MSC 呈成纤维样形态, 指数生长期倍增 时间约为16h, 细胞增殖26.5 倍。传代15 次仍有94.18%的细胞处于G0/G1 期。流式细胞仪检测结果显示人胎 肝MSC 表达CD29、CD44、CD105、CD106 和CD166, 不表达CD31、CD34、CD45, 不表达与GVHD 相关的HLADR 、CD80、CD86、CD40、CD40L。免疫荧光检测结果显示胎肝MSC 表达造血微环境细胞外基质蛋白 Fibronectin、α-SMA 及上皮细胞标记蛋白AFP 和E-cadherin。【结论】人胎肝MSC 具有胚胎造血组织和发育中的 肝脏特异的相关分子表达, 免疫原性弱, 可以作为研究造血、胎肝发育机制的模式细胞。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究

目的 通过体外细胞培养和贴壁筛选法将骨髓间充质干细胞由骨髓中分离纯化并加以鉴定，观察该细胞的生物学特性，为其用于组织工程提供实验基础。方法 提取骨髓，通过离心和贴壁筛选培养获取骨髓间充质干细胞，原位杂交检测骨髓间充质干细胞的表面标志CD44对培养细胞进行鉴定；测定其生长曲线和贴壁率。结果 通过体外培养和贴壁筛选可获得骨髓间充质干细胞，该细胞在体外培养条件下可在短时间内贴壁生长，增殖速度迅速，适应性强，长期传代不改变其生物学特性。结论 体外细胞培养和贴壁筛选能有效分离纯化免骨髓间充质干细胞，细胞扩增稳定。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中除了造血干细胞(HSCs)外的另一种干细胞,不仅直接参与生成造血微环境支持造血,在适宜的条件下还可发育、分化为具有支持造血功能的多种骨髓基质细胞。因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能,是细胞替代和基因治疗理想的细胞来源。目前,临床研究的焦点集中于BMSCs对造血微环境(HME)损伤的修复,从而促进移植后造血和免疫功能的重建。     

胎儿心脏间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的建立胎儿心脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法,并检测其表面标志及多向分化潜能。方法取胎龄4~5月水囊引产胎儿心脏,用1.073 g/mL的Percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSC培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,并与胎儿骨髓MSC对比,研究其增生及生长特征。结果流式细胞术证明,胎心MSC表达干细胞标志,具有间充质细胞的特征及多向分化能力。原代及传代培养显示,同胎儿骨髓MSC一样,胎儿心脏MSC具有活跃增生的能力。结论胎儿心脏中可成功地分离MSC,为组织工程的种子细胞和基因工程的载体细胞提供了新的可行的来源。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的：分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨其生物学特性,为组织工程和基因工程提供优势靶细胞。方法：全骨髓细胞贴壁法进行BMSCs的原代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原,MTT法检测BMSCs增殖能力,并绘制生长曲线。结果：原代培养24h后看见少量贴壁细胞,初起为小圆形,3d后可见梭形类似成纤维细胞,呈漩涡样生长,传3~6代细胞均一性良好,10代以后细胞逐渐有宽大梭形样变,增殖减慢,偶有细胞漂浮、死亡。流式细胞仪检测传3代细胞CD29表达率为92%,CD34几乎无表达。生长曲线显示,传3、6代BMSCs有较强的增殖能力,其中传6代细胞更为明显,传10代细胞的增殖能力较前有所减弱。结论：成功从大鼠骨髓组织分离、培养BMSCs,纯度高,生物学特性符合正常干细胞生长规律,是组织工程和基因工程理想的靶细胞。     

Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的对Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）进行分离培养,并检测其生物学特性。方法采用0．85％NH4Cl分离培养Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs,检测生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力鉴定。结果BMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力。第5代细胞生长速度较第3代略减慢。细胞周期显示93．79％细胞处于G0～G1期。表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达CD29和CD90,几乎不表达CD45。在体外能够向成骨细胞分化。结论Long-Evans大鼠股骨来源骨髓间充质干细胞经0．85％NH4Cl分离培养后,纯度高,具有良好生物学特性。     

间充质干细胞在造血干细胞移植中的作用

造血干细胞移植（HSCT ）是治疗血液系统恶性疾病的有效手段,由于造血恢复延迟、免疫重建缓慢及移植物抗宿主病（graft versus host disease ,GVHD）等,均影响移植成败。作为造血微环境的重要组成成分的间充质干细胞（mesenchymal stem cells ,MSCs）来源广泛、取材方便、可进行体外扩增,可分泌多种细胞因子,能够促进造血,具有免疫调节能力,使其在移植中存在应用潜力。     

骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）亦称骨髓基质干细胞（bone mar-row stromal cells,BMSCs）,是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞,在一定的诱导条件下,可分化为多种胚层细胞[1-2],更重要的是骨髓间充质干细     

兔骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的建立体外分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的最佳条件，观察其生物学活性及诱导分化，初步探索MSC在生物材料支架内的增殖情况。方法采用Percoll(比重1．073)或Ficoll(比重1．007g／ml)分离骨髓单个核细胞，以含10％的胎牛血清DMEM／F12作为培养体系，用体外贴壁培养的方法筛选MSC。用流式细胞仪测定其细胞周期，以MTT比色法测定细胞增殖活性并计算其倍增时间，检测MSC的细胞化学特征，体外观察MSC在特定的诱导体系下向成骨和脂肪细胞分化，并用电镜观察了MSC在生物材料支架内的生长情况。结果用此方法分离培养的MSC经9天左右的淘汰培养即可得到第一代的细胞。细胞化学染色碱性磷酸酶、苏丹黑B、过氧化物酶阴性，非特异性酯酶、糖原呈阳性。培养扩增的细胞形态呈梭状，具有较快的增殖能力，细胞倍增时间在19．4h。2～8代的细胞呈均质状，且具有较好的多向分化的能力。结论分离培养的兔骨髓间充质干细胞在体外具有多向细胞分化的能力，具有人骨髓间充质干细胞生物学特性。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离培养的适宜条件。方法取1、2、4个月大鼠各6只,分离MSCs,以0.5×105/m l、1×105/m l、2×105/m l密度接种,通过倒置显微镜观察MSCs增殖情况,绘制生长曲线。流式细胞仪观察细胞周期并绘制细胞周期图。结果利用贴壁法成功培养出MSCs并能使之分裂增殖,但随着传代次数的增加,增殖能力有所下降。在培养过程中大鼠年龄要控制在2月以内,接种密度以1×105/m l适宜。结论贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs常规方法。     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的 通过提取兔骨髓中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)并加以纯化，在体外培养条件下研究其增殖及生长特性。方法 从骨髓中提取间充质干细胞，体外培养扩增，再以相差显微镜、电镜观察并绘制生长曲线。结果 原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力；骨髓间充质干细胞内细胞器与其生物活性变化相一致。结论 骨髓间充质干细胞体外培养成功，为今后利用自体间充质干细胞通过组织工程学方法修复软骨、骨、肌肉系统的组织缺损奠定了基础。     

不同来源人角膜缘干细胞的体外培养研究

目的探讨胎儿和成人角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法应用消化培养法对胎儿和成人角膜缘上皮组织分别进行体外培养,观察记录培养细胞的生长特性并计算其克隆形成率(colony-form-ing efficiency,CFE)。对胎儿和成人角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测;并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果胎儿角膜缘干细胞原代培养时生长旺盛,8~10 d达到生长高峰,CFE为(26.18±4.75)%,传代时保持高增殖速率;成人角膜缘干细胞原代培养时生长不及胎儿细胞旺盛,6~8d达到生长高峰,CFE为(15.45±3.88)%,随着传代次数增加其增殖能力明显下降;两种细胞原代培养时CFE值差异有显著性(t=6.78,P<0.001)。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞,并见较多HLA-DR阳性细胞;胎儿原代培养细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性,AE1和PCNA阳性;传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分;成人角膜缘组织及培养细胞染色结果则见上述干细胞特征细胞数量比例较低,而HLA-DR染色结果相似。扫描电镜观察胎儿原代细胞以球形或短圆柱形为主,表面多突起和微绒毛,成人原代细胞形态相似,但直径较大。结论采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力等干细胞特性的胎儿角膜缘干细胞,其抗原性较培养前明显降低,且其生物学特性显著优于成人角膜缘干细胞,是一种新的优越的角膜缘干细胞来源,将在临床眼表重建中展现广阔的应用前景。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。